發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 14:37

【摘要】：目的:石斛屬植物有1200-1500種,其中大多數(shù)都具有重要的藥用和觀賞價(jià)值。由于石斛屬植物種間、種內(nèi)形態(tài)相似、分布范圍廣泛、雜交種眾多,市場上常出現(xiàn)質(zhì)量參差不齊的石斛類藥材及其混偽品,致使其用藥安全和用藥質(zhì)量難以保證。目前,DNA條形碼技術(shù)被認(rèn)為是有較好前景的,可以進(jìn)行快速精確的物種鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析方法。盡管使用單一位點(diǎn)或者多位點(diǎn)結(jié)合的DNA條形碼都能對石斛屬物種進(jìn)行不同程度的鑒定,但其鑒別效果均存在一定的局限。近年來,隨著基因組測序技術(shù)的不斷成熟,植物全葉綠體基因組(Complete chloroplast genome,cp-genome)常被用以進(jìn)行物種分類鑒定及遺傳進(jìn)化分析。本研究結(jié)合Illumina HiSeq 4000和Pacific Biosciences RSII兩大測序平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn),獲得高質(zhì)量的中科4號(hào)鐵皮石斛cp-genome序列,進(jìn)行基因注釋并繪制其完整的基因結(jié)構(gòu)圖。再以此cp-genome為參考基因組,用Illumina平臺(tái)對41種50個(gè)石斛屬樣本的cp-genome進(jìn)行深度重測序。對所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)和群體遺傳學(xué)分析,尋找51株石斛屬植物cp-genome的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)、小片段插入缺失(Insertion-deletion,InDel)位點(diǎn),構(gòu)建石斛屬系統(tǒng)進(jìn)化樹,闡述石斛屬物種間的親緣關(guān)系,建立石斛屬植物cp-genome鑒定系統(tǒng)。比較基于cp-genome中編碼基因、非編碼基因、SNP位點(diǎn)豐富的單基因及不同基因組合對石斛屬植物的鑒別和分類效果,篩選出對石斛的鑒別和分類效果較好的基因片段,作為候選DNA條形碼序列。再以79個(gè)蘭科植物的DNA為模版,同時(shí)進(jìn)行候選DNA條形碼序列和ITS2、matK序列的擴(kuò)增測序和聚類分析,分別基于石斛屬cp-genome序列、候選DNA條形碼序列、ITS2序列及matK序列的分類鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果進(jìn)行比較,以驗(yàn)證和評價(jià)本研究所用DNA條形碼序列在石斛屬分類鑒定和系統(tǒng)分析中的作用。方法:1.樣本采集及DNA提取:采集實(shí)驗(yàn)樣本新鮮葉片,70%的酒精處理后,于-80℃保存。分離提取石斛屬樣本完整的cp-genome DNA,NanoDrop2000檢測DNA純度,Qubit熒光計(jì)檢測DNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,用covaris S220構(gòu)建文庫,進(jìn)行橋式PCR,產(chǎn)生DNA簇,將DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈。2.Cp-genome測序及測序原始數(shù)據(jù)分析:采用Truseq SBS Kit v3-HS(300cycles)試劑盒法進(jìn)行Illumina Hiseq4000平臺(tái)測序;利用G-tubes方法進(jìn)行PacBio RSII平臺(tái)測序。通過生物信息統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法,對所有測序reads的每個(gè)circle進(jìn)行堿基分布和質(zhì)量波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)。對Illumina Hiseq的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切,將單分子測序獲得的每條read原始數(shù)據(jù)繪制成長度分布圖。3.Cp-genome組裝注釋:用SOAPdenovo(v2.04)初步組裝Illumina測序數(shù)據(jù),然后用BLASR軟件比對Pacbio的測序數(shù)據(jù),再用Celera Assembler 8.0軟件進(jìn)行后續(xù)組裝。利用Illumina數(shù)據(jù)進(jìn)行校驗(yàn),同時(shí)用軟件GapCloser v1.12進(jìn)行g(shù)ap closing操作。用DOGMA進(jìn)行基因預(yù)測和注釋,繪制中科4號(hào)鐵皮石斛完整的cp-genome基因結(jié)構(gòu)圖。通過與string v9.05數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTP(BLAST 2.2.28+)比對,獲得基因所對應(yīng)的COG注釋結(jié)果,并根據(jù)COG注釋結(jié)果對蛋白進(jìn)行功能歸類;運(yùn)用BLAST算法(blastX/blastP 2.2.28+)將所獲得的預(yù)測基因與KEGG的基因數(shù)據(jù)庫(Genes)進(jìn)行比對,根據(jù)比對得到的KO編號(hào)獲得相應(yīng)基因參與的具體生物學(xué)通路;最后通過BLAST2go軟件對BLAST結(jié)果進(jìn)行GO注釋分析。4.構(gòu)建石斛“cp-DNA-Barcode”鑒定系統(tǒng):將獲取的50個(gè)石斛屬樣本cp-genome DNA進(jìn)行Illumina重測序,BWA軟件將測序得到的reads與參考基因組序列進(jìn)行比對,計(jì)算出相對于參考基因組的測序深度和覆蓋度。GATK軟件檢測所測基因組單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)、小片段插入缺失(Insertion-deletion,Indel),用本地腳本獲得群體SNP集合。Mega7.02采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用群體SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA(Principal Component Analysis)主成分分析。5.基于石斛屬cp-genome序列信息及SNP分布信息篩選候選DNA條形碼序列,用植物DNA提取試劑盒提取驗(yàn)證樣品的總DNA為模板,進(jìn)行ITS2、matK、及候選DNA條形碼的PCR擴(kuò)增和測序。用BioEdit 7.0、SnapGene Viewer 2.6.2和Mega 7.02對所得序列進(jìn)行拼接組裝、分析并提交至GenBank,基于候選DNA條形碼序列和ITS2、matK序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,預(yù)測ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1.建立了基于Illumina平臺(tái)及PacBio RSII平臺(tái)的cp-genome全序列測序方案;獲得了中科4號(hào)鐵皮石斛高質(zhì)量的cp-genome序列,總大小為152,185 bp,其中大單拷貝區(qū)(Large single copy,LSC)長85,094 bp,小單拷貝區(qū)(Small single copy,SSC)長14,521 bp兩個(gè)插入重復(fù)區(qū)(Inverted repeat,IRs)長26,285 bp。Cp-genome GC含量為37.46%,其中127個(gè)基因被成功注釋,包括89個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、30個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因,分別占總cp-genome大小的比例為53.86%、6.92%和1.48%。有12個(gè)基因(atpF、clpP、ndhB-、ndhB+、ndhF、rpl2-、rpl2+、rpoC1、ycf1、ycf15-、ycf15+、ycf3)包含1-2個(gè)introns。2.COG注釋結(jié)果表明石斛屬cp-genome中參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源,能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換的基因數(shù)最多,分別為33、26個(gè);KEGG基因功能注釋分析結(jié)果表明參與代謝途徑、光合作用及核糖體的基因數(shù)最多,分別為38、29、21個(gè);GO注釋到66個(gè)基因在細(xì)胞組成、生物學(xué)途徑和分子功能中的參與率分別為50%~100%、1.51%~93.93%和9.09%~63.63%。3.重測序獲得50條石斛屬植物的cp-genome序列,檢測出35,685個(gè)SNP以及3,944個(gè)InDel。SNP變異發(fā)生在基因的內(nèi)含子、外顯子、上游、下游和基因間隔區(qū)中所占的比例分別為31.10%、28.49%、23.21%、15.22%、1.98%。InDel變異發(fā)生在基因的內(nèi)含子、上游、下游、外顯子和基因間隔區(qū)中所占的比例分別為44.27%、31.52%、17.60%、4.54%、2.08%。4.采用K2P模型計(jì)算的51個(gè)石斛樣本的種間遺傳距離的范圍是0.000-0.025,其中為0的只占0.08%,而遺傳距離0.0075占88.1%;種內(nèi)遺傳距離的范圍是0.000-0.005,且本研究中有88.24%種內(nèi)樣本擁有自己獨(dú)一無二的cp-genome序列。采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可100%的對51個(gè)石斛樣本進(jìn)行分類鑒定。5.基于石斛屬SNP分布信息及cp-genome序列信息篩選出ycf1b和clpP-psbB作為候選DNA條形碼。matK、ycf1b、clpP-psbB對51個(gè)石斛樣本的鑒別率分別為96.25%、97.50%、97.50%,而當(dāng)樣本數(shù)為80個(gè)時(shí)ITS2、matK、ycf1b和clpP-psbB的鑒別率分別為90.00%,87.50%,92.59%和45.00%。此外,基于clpP-psbB序列的聚類結(jié)果則與傳統(tǒng)的分類結(jié)果有較大差異,且置信度均較低;而基于ITS2、matK、ycf1b序列的聚類結(jié)果置信度均較高。根據(jù)四個(gè)螺旋臂構(gòu)型、大小、臂環(huán)數(shù)、臂環(huán)位置和臂環(huán)夾角間的差異,將79個(gè)樣本的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)大致分為A、B、C、D四類,來自同一物種不同產(chǎn)地的兩個(gè)樣本的ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)也存在一定的差異,如鐵皮石斛、報(bào)春石斛(D.primulinum)、疊鞘石斛(D.aurantiacum)和喇叭唇石斛(D.lituiflorum)等。此外,基于ITS2、matK、ycf1b序列的聚類結(jié)果均顯示未分組的石斛屬植物檀香石斛(D.anosmum)與黑毛石斛(D.williamsonii)、喉紅石斛(D.christyantum)與翅萼石斛(D.cariniferum)、姬竹葉石斛(D.hainanensis)與竹葉石斛(D.hancockii)具有較近的親緣關(guān)系。結(jié)論:1.基于cp-genome能夠100%的鑒別本研究中來自41個(gè)種的51個(gè)石斛屬樣本,還能有效鑒別本研究中3個(gè)不同產(chǎn)地來源(浙江、]\0山和四川)的鐵皮石斛。所獲得的相對較大的野生石斛屬cp-genome數(shù)據(jù)庫,將為國內(nèi)大多數(shù)石斛屬植物提供準(zhǔn)確可靠的參考序列,而龐大的SNP矩陣集也將為大多數(shù)藥用石斛道地性標(biāo)記序列的設(shè)計(jì)提供有用的數(shù)據(jù)。2.本研究基于51條石斛屬編碼和非編碼基因、單一基因以及2個(gè)、3個(gè)、10個(gè)、16個(gè)基因組合構(gòu)建的ML樹及鑒別效率發(fā)現(xiàn),基于ycf1b的ML樹與基因整個(gè)cp-genome的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、分類結(jié)果及鑒別效率最相近,基于2個(gè)、3個(gè)、10個(gè)、16個(gè)基因組合的序列在系統(tǒng)分類和鑒別效率上均未較ycf1b好,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明ycf1b對石斛屬植物有較好的分類鑒定效果。3.ITS2、matK、ycf1b序列均能鑒別本實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)的石斛屬物種,但都不能用于鑒別所有的石斛屬物種,且無論是基于matK、ycf1b還是clpP-psbB序列,隨著實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量的增長其物種鑒別率就相應(yīng)的下降�；�于ITS2、matK、ycf1b序列的聚類結(jié)果置信度均較基于clpP-psbB序列的高,分類鑒定結(jié)果更可靠。這些序列信息能為大多數(shù)石斛屬的物種鑒定提供可靠的依據(jù),且為物種分類學(xué)和生物信息學(xué)的研究提供重要的系統(tǒng)進(jìn)化信息。而ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)可在一定程度上輔助分析石斛物種之間的演化關(guān)系。本研究在石斛屬DNA條形碼研究中的探索思路和方法以及獲得的成果,將為石斛屬DNA條形碼的后續(xù)研究提供重要參考。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R282.5
【圖文】：

1-51 對應(yīng)對應(yīng)表 2、表 3 中樣品 WSH001-WSH051。圖 1 石斛屬樣本葉綠體 DNA 凝膠電泳圖2.2.2 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)量剪切及統(tǒng)計(jì)結(jié)果2.2.2.1 Illumina Hiseq 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量見圖 2，A、C、G、T 在開始有所波動(dòng)，而后趨于穩(wěn)定。一般情況下 A 與 T 相等，C 與 G 相等，各堿基所占百分比會(huì)因物種差異而不同，此基因組建庫比較均勻，代表不同堿基的四種顏色的分界線波動(dòng)極小。該文庫質(zhì)量值特別低，沒有信號(hào)的堿基 N 的比例非常低，且堿基質(zhì)量良好（圖 3），可用于后續(xù)分析。注：橫坐標(biāo)是 reads 堿基坐標(biāo)，縱坐標(biāo)是所有 reads 的 A、C、G、T、N 堿基分別占的百分比。圖 2 原始數(shù)據(jù)堿基組成分布圖

21s 的長度，縱坐標(biāo)為不同長度 reads 的數(shù)目。 4 單分子 Clean 數(shù)據(jù)序列的長度分布統(tǒng)計(jì)因組測序生物信息學(xué)分析皮石斛葉綠體基因組組裝和注釋方法8]等人的方法，利用 SOAPdenovo（v2.04）、me 組裝。皮石斛葉綠體基因組組裝和注釋結(jié)果斛環(huán)化葉綠體基因組序列總長度為總大小為rge single copy region，LSC）長 85，094 bp，小

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2739794