【摘要】：研究目的:通過構(gòu)建和篩選南瓜蛋白雜交瘤陽性株,以及制備和純化南瓜蛋白單克隆抗體,從而構(gòu)建南瓜蛋白免疫親和層析柱,并探索南瓜蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用。研究方法:一、南瓜蛋白單克隆抗體的制備及純化1.用天然提取的南瓜蛋白免疫Balb/C小鼠,融合小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞和南瓜蛋白免疫的小鼠脾細(xì)胞來構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞;2.通過HAT培養(yǎng)基和亞克隆培養(yǎng)篩選陽性株;3.液體石蠟致敏Balb/C小鼠,通過腹腔注射雜交瘤陽性株誘生腹水來制備南瓜蛋白單克隆抗體;4.通過飽和硫酸銨(SAS)鹽析法和Protein G親和層析法來純化南瓜蛋白單克隆抗體;5.通過SDS-PAGE對(duì)比南瓜蛋白單克隆抗體純化前后效果;二、南瓜蛋白單克隆抗體的鑒定及檢測(cè)1.通過蛋白免疫印跡法(Western blotting,WB)識(shí)別南瓜蛋白單克隆抗體對(duì)南瓜蛋白及以其為效應(yīng)分子的免疫毒素;2.通過間接酶聯(lián)免疫吸附法(indirect Enzyme Linked Immunosorbant Assay,i ELISA)檢測(cè)南瓜蛋白單克隆抗體的效價(jià);3.通過octect檢測(cè)南瓜蛋白單克隆抗體的親和力;4.通過抗體亞型試劑盒檢測(cè)抗體亞型;三、南瓜蛋白免疫親和層析柱的構(gòu)建及應(yīng)用1.通過CNBr活化的Sepharose 4B偶聯(lián)南瓜蛋白單克隆抗體,從而構(gòu)建南瓜蛋白免疫親和層析柱;2.用構(gòu)建的南瓜蛋白免疫層析柱來純化南瓜蛋白及以南瓜蛋白為效應(yīng)分子的免疫毒素;3.通過SDS-PAGE對(duì)比南瓜蛋白和以南瓜蛋白為效應(yīng)分子的免疫毒素的純化前后效果;4.通過磺酰羅丹明(SRB)比色法檢測(cè)純化后的南瓜蛋白及南瓜蛋白為效應(yīng)分子的免疫毒素的體外抗腫瘤活性。研究結(jié)果:1.獲得3株特異性強(qiáng),親和力高的南瓜蛋白單克隆抗體(1B2,1G9,2E12);2.經(jīng)檢測(cè),南瓜蛋白單克隆抗體的效價(jià)均為1:10000000;3.經(jīng)檢測(cè),三株南瓜蛋白單克隆抗體均為Ig G1,κ亞型;4.經(jīng)檢測(cè),三株南瓜蛋白單克隆抗體和南瓜蛋白的親和力KD值均小于10-12;5.成功純化1B2,1G9兩株南瓜蛋白單克隆抗體;6.成功構(gòu)建具有南瓜蛋白特異性的免疫親和層析柱;7.經(jīng)檢測(cè),純化后的南瓜蛋白及南瓜蛋白為效應(yīng)分子的免疫毒素仍具有體外抗腫瘤活性。結(jié)論:1.成功制備三株高特異性,高親和力的南瓜蛋白單克隆抗體(1B2,1G9,2E12),亞型均為Ig G1,kappa;2.成功構(gòu)建了南瓜蛋白特異性的免疫親和層析柱;3.通過免疫親和層析柱成功純化了天然南瓜蛋白,重組南瓜蛋白以及以南瓜蛋白為效應(yīng)分子的免疫毒素。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R284

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2738140