發(fā)布時間：2020-07-01 13:07

【摘要】：目的:考察大葉冬青葉三萜類成分體內、外抑制乳腺癌細胞增殖的作用,篩選大葉冬青葉三萜類成分抗乳腺癌的活性成分,探討其抗乳腺癌的作用機制;對大葉冬青進行質量標準研究,建立HPLC測定大葉冬青葉中多種三萜類成分含量的方法,并結合中藥指紋圖譜探討不同產地、不同采收期大葉冬青葉中三萜類成分的含量差異,為大葉冬青葉的質量控制和臨床應用提供科學依據(jù)。方法:1)采用MTT法比較大葉冬青葉中三萜類成分對人乳腺癌MDA-MB-231細胞和人宮頸癌Hela細胞增殖的抑制作用。使用流式細胞儀檢測27-O-p-(E)-coumaroyl ursolic acid(C-Ur)和大葉冬青葉乙酸乙酯萃取部位(EtoAc-P)誘導MDA-MB-231細胞和Hela細胞凋亡的能力。選用MTT法和流式細胞儀檢測不同濃度C-Ur誘導MDA-MB-231細胞凋亡的效果。Wstern-Blot法檢測C-Ur體外誘導MDA-MB-231細胞凋亡的相關蛋白的表達和抑制EGFR表達水平。測定不同濃度C-Ur對EGFR酪氨酸激酶的抑制作用,流式細胞儀測定加入siRNA EGFR和Lapatinib的MDA-MB-231細胞中的EGFR表達。體內實驗研究給藥C-Ur后在無胸腺小鼠體內對腫瘤形成的影響及相關通路的表達。2)建立大葉冬青葉三萜類成分含量定量分析方法,采用HPLC法同時測定大葉冬青葉中地榆皂苷Ⅱ、坡模酸、27-O-p-coumaroyl ursolic acid、胡蘿卜苷、3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide、烏發(fā)醇6種三萜類成分的含量。使用Agilent HC-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫,檢測波長205 nm,柱溫30℃,流速1.0 mL/min,進樣量10μL。結合中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)軟件進行指紋圖譜分析。3)采用YMC-ODS C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,以甲醇-0.4%磷酸水溶液(98:2)為流動相等度洗脫,流速1 mL/min,檢測波長205 nm,柱溫30℃,進樣量20μL,建立同時測定羽扇豆醇、豆甾醇、α-香樹脂素含量的方法。結果:1)MTT法檢測結果顯示大葉冬青葉中C-Ur、(20S,24S)-Epoxydammarane-3β,25-diol、25-Deuteriostigmasteroll、α-amyrin、pomolic acid3-O-α-L-arabinopyranoside、ursolic acid、oleanolic acid、β-sitosterol和β-daucosterol等化合物以及大葉冬青葉EtoAc-P、正丁醇萃取部位對MDA-MB-231細胞和Hela細胞均具有抑制作用,其中C-Ur和EtoAc-P對兩種癌細胞的抑制效果最好。流式細胞儀檢測出C-Ur誘導MDA-MB-231細胞凋亡的效果強于EtoAc-P,呈劑量依賴型抑制MDA-MB-231細胞增殖,給藥的MDA-MB-231細胞中C-caspase-3表達與治療中MDA-MB-231細胞的凋亡率平行增加,PARP1表達被明顯抑制。C-Ur可抑制MDA-MB-231細胞中EGFR的過表達和劑量依賴型抑制EGFR酪氨酸激酶的活性,IC_(50)為56.48 nmol,但對EGFR被抑制的MDA-MB-231細胞無抑制作用。體內實驗表明C-Ur可抑制小鼠體內腫瘤生長,下調PI3K/AKT/mTOR和干擾Ras-Raf-MEK-ERK信號通路。2)大葉冬青葉中地榆皂苷Ⅱ、坡模酸、27-O-p-coumaroyl ursolic acid、胡蘿卜苷、3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide、烏發(fā)醇6種三萜類化合物均有良好的分離度,線性范圍分別為:4.70~235.00(r=0.999 9),6.94~347.00(r=1.000 0),12.60~630.00(r=0.999 6),36.24~1812.00(r=0.999 9),2.08~104.00(r=0.999 7),28.62~1431.00 mg/L(r=0.999 9),線性關系良好,平均加樣回收率在98.18%~102.64%,RSD均小于3%(n=6)。14批同產地不同采收時期大葉冬青葉樣品指紋圖譜相似度大于0.9,表明樣品一致性良好。10批不同產地大葉冬青葉樣品指紋圖譜相似度較低存在明顯差異。3)在上述色譜條件下羽扇豆醇、豆甾醇、α-香樹脂素分離度良好,分別在質量溶度18.88~906.00 mg/L(r=1.000 0,n=6)、15.06~723.00 mg/L(r=0.999 9,n=6)、22.75~1092.00 mg/L(r=0.999 9,n=6)呈良好的線性關系,平均加樣回收率(n=6)分別為100.43%(RSD=1.96%)、98.72%(RSD=0.88%)、102.86%(RSD=2.47%)。結論:大葉冬青葉中三萜類成分C-Ur在體外能夠有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖,促進細胞凋亡�？勺鳛橐环NEGFR酪氨酸激酶抑制劑下調PI3K/AKT/mTOR和干擾Ras-Raf-MEK-ERK信號通路作用于MDA-MB-231細胞,誘導細胞凋亡。建立的兩種HPLC方法均簡單方便、結果準確、重復性好,可用于測定大葉冬青葉中多種三萜類成分的含量,結合大葉冬青葉指紋圖譜研究可為大葉冬青質量標準的建立提供更加全面的理論依據(jù)。且不同產地及不同采收時期大葉冬青葉中三萜類成分含量存在明顯差異。
【學位授予單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284.1
【圖文】：

皖南醫(yī)學院碩士學位論文α-amyrin >80μM oleanolic acid >80 μM EtoAc-P 5.05 ± 0.48 μg/mL 11.正丁醇部位萃取部位 >80 μg/mL 3.2 流式細胞儀檢測 EtoAc-P 和 C-Ur 對腫瘤細胞凋亡的采用Annexinv-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測C-Ur和EtoAc-P對細胞和 Hela 細胞凋亡的影響（藥物選取 IC50左右的濃度），計算果表明，C-Ur 和 EtoAc-P 均能夠明顯促進 MDA-MB-231 細胞和 H并且對 MDA-MB-231 細胞的促凋亡效果明顯優(yōu)于 Hela 細胞，提示 有一定的抗腫瘤選擇性和特異性（見圖 1-1、1-2，見表 1-4、1-5）

圖 1-2 C-Ur 和 EtoAc-P 對 Hela 細胞凋亡的影響表 1-4 C-Ur 和 EtoAc-P 對 MDA-MB-231 細胞的凋亡影響Ac-P 0 μg/mL 5 μg/mL期凋亡率 6.87% 0.22%期凋亡率 2.36% 42.98%凋亡率 9.23% 43.2%Ur 0 μM 12.5 μM期凋亡率 0.91% 30.43%期凋亡率 0.50% 1.99%凋亡率 1.41% 32.42%表 1-5 C-Ur 和 EtoAc-P 對 Hela 細胞的凋亡率

【相似文獻】

相關期刊論文 前9條

1 陳穎;王存琴;汪雷;鄭婷;鄭述梁;黃超;;大葉冬青葉中8種活性成分提取工藝研究[J];皖南醫(yī)學院學報;2019年01期

2 李曉儲;蔣繼宏;方德蘭;高甜惠;曹小迎;黃利斌;;大葉冬青葉若干生化指標測定及抗菌活性研究[J];揚州大學學報;2006年01期

3 陳鳳美;李曉儲;楊守輝;馮友建;蔣繼宏;;大葉冬青葉抗腫瘤活性初步研究[J];林業(yè)科技開發(fā);2007年05期

4 王存琴;陳穎;汪雷;臧莉;鄭述梁;陳雪林;;HPLC法同時測定大葉冬青葉中6種有效成分的含量[J];中藥新藥與臨床藥理;2019年04期

5 梁益敏,武祖發(fā),姚強;大葉冬青葉的顯微鑒定[J];時珍國藥研究;1998年03期

6 姚敏娜;舒任庚;李韋韋;竇芳;張偉;卜偉;文愛東;;大葉冬青葉的化學成分及其抗氧化活性研究[J];中國藥師;2018年11期

7 李曉儲,蔣繼宏,黃利斌,馬東躍,黃鐘玉,劉根林,李玉巧,梁珍海,蔣澤平;優(yōu)良觀賞保健樹大葉冬青擴繁利用研究[J];江蘇林業(yè)科技;2004年05期

8 張俊清;譚銀豐;李海龍;劉明生;范春林;葉文才;;海南大葉冬青中2種活性成分的含量研究[J];中國藥學雜志;2010年09期

9 曠春桃;李湘洲;汪玉霞;劉慎;吳斌;;大葉冬青葉中總黃酮測定方法和提取工藝研究[J];食品科學;2009年06期

相關會議論文 前1條

1 張俊清;譚銀豐;李海龍;劉明生;范春林;葉文才;;海南大葉冬青中2種活性成分的含量研究[A];海南省藥學會二○一○年學術年會會議論文集[C];2010年

相關碩士學位論文 前1條

1 陳穎;大葉冬青葉三萜類成分抗乳腺癌作用及質量標準研究[D];皖南醫(yī)學院;2019年

本文編號：2736798