發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 13:07

【摘要】：目的:考察大葉冬青葉三萜類成分體內(nèi)、外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用,篩選大葉冬青葉三萜類成分抗乳腺癌的活性成分,探討其抗乳腺癌的作用機(jī)制;對大葉冬青進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,建立HPLC測定大葉冬青葉中多種三萜類成分含量的方法,并結(jié)合中藥指紋圖譜探討不同產(chǎn)地、不同采收期大葉冬青葉中三萜類成分的含量差異,為大葉冬青葉的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法:1)采用MTT法比較大葉冬青葉中三萜類成分對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用。使用流式細(xì)胞儀檢測27-O-p-(E)-coumaroyl ursolic acid(C-Ur)和大葉冬青葉乙酸乙酯萃取部位(EtoAc-P)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞和Hela細(xì)胞凋亡的能力。選用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測不同濃度C-Ur誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的效果。Wstern-Blot法檢測C-Ur體外誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白的表達(dá)和抑制EGFR表達(dá)水平。測定不同濃度C-Ur對EGFR酪氨酸激酶的抑制作用,流式細(xì)胞儀測定加入siRNA EGFR和Lapatinib的MDA-MB-231細(xì)胞中的EGFR表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究給藥C-Ur后在無胸腺小鼠體內(nèi)對腫瘤形成的影響及相關(guān)通路的表達(dá)。2)建立大葉冬青葉三萜類成分含量定量分析方法,采用HPLC法同時(shí)測定大葉冬青葉中地榆皂苷Ⅱ、坡模酸、27-O-p-coumaroyl ursolic acid、胡蘿卜苷、3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide、烏發(fā)醇6種三萜類成分的含量。使用Agilent HC-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,檢測波長205 nm,柱溫30℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10μL。結(jié)合中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A)軟件進(jìn)行指紋圖譜分析。3)采用YMC-ODS C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,以甲醇-0.4%磷酸水溶液(98:2)為流動(dòng)相等度洗脫,流速1 mL/min,檢測波長205 nm,柱溫30℃,進(jìn)樣量20μL,建立同時(shí)測定羽扇豆醇、豆甾醇、α-香樹脂素含量的方法。結(jié)果:1)MTT法檢測結(jié)果顯示大葉冬青葉中C-Ur、(20S,24S)-Epoxydammarane-3β,25-diol、25-Deuteriostigmasteroll、α-amyrin、pomolic acid3-O-α-L-arabinopyranoside、ursolic acid、oleanolic acid、β-sitosterol和β-daucosterol等化合物以及大葉冬青葉EtoAc-P、正丁醇萃取部位對MDA-MB-231細(xì)胞和Hela細(xì)胞均具有抑制作用,其中C-Ur和EtoAc-P對兩種癌細(xì)胞的抑制效果最好。流式細(xì)胞儀檢測出C-Ur誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的效果強(qiáng)于EtoAc-P,呈劑量依賴型抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖,給藥的MDA-MB-231細(xì)胞中C-caspase-3表達(dá)與治療中MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率平行增加,PARP1表達(dá)被明顯抑制。C-Ur可抑制MDA-MB-231細(xì)胞中EGFR的過表達(dá)和劑量依賴型抑制EGFR酪氨酸激酶的活性,IC_(50)為56.48 nmol,但對EGFR被抑制的MDA-MB-231細(xì)胞無抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明C-Ur可抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長,下調(diào)PI3K/AKT/mTOR和干擾Ras-Raf-MEK-ERK信號通路。2)大葉冬青葉中地榆皂苷Ⅱ、坡模酸、27-O-p-coumaroyl ursolic acid、胡蘿卜苷、3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide、烏發(fā)醇6種三萜類化合物均有良好的分離度,線性范圍分別為:4.70~235.00(r=0.999 9),6.94~347.00(r=1.000 0),12.60~630.00(r=0.999 6),36.24~1812.00(r=0.999 9),2.08~104.00(r=0.999 7),28.62~1431.00 mg/L(r=0.999 9),線性關(guān)系良好,平均加樣回收率在98.18%~102.64%,RSD均小于3%(n=6)。14批同產(chǎn)地不同采收時(shí)期大葉冬青葉樣品指紋圖譜相似度大于0.9,表明樣品一致性良好。10批不同產(chǎn)地大葉冬青葉樣品指紋圖譜相似度較低存在明顯差異。3)在上述色譜條件下羽扇豆醇、豆甾醇、α-香樹脂素分離度良好,分別在質(zhì)量溶度18.88~906.00 mg/L(r=1.000 0,n=6)、15.06~723.00 mg/L(r=0.999 9,n=6)、22.75~1092.00 mg/L(r=0.999 9,n=6)呈良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率(n=6)分別為100.43%(RSD=1.96%)、98.72%(RSD=0.88%)、102.86%(RSD=2.47%)。結(jié)論:大葉冬青葉中三萜類成分C-Ur在體外能夠有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。可作為一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑下調(diào)PI3K/AKT/mTOR和干擾Ras-Raf-MEK-ERK信號通路作用于MDA-MB-231細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。建立的兩種HPLC方法均簡單方便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于測定大葉冬青葉中多種三萜類成分的含量,結(jié)合大葉冬青葉指紋圖譜研究可為大葉冬青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供更加全面的理論依據(jù)。且不同產(chǎn)地及不同采收時(shí)期大葉冬青葉中三萜類成分含量存在明顯差異。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284.1
【圖文】：

皖南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文α-amyrin >80μM oleanolic acid >80 μM EtoAc-P 5.05 ± 0.48 μg/mL 11.正丁醇部位萃取部位 >80 μg/mL 3.2 流式細(xì)胞儀檢測 EtoAc-P 和 C-Ur 對腫瘤細(xì)胞凋亡的采用Annexinv-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測C-Ur和EtoAc-P對細(xì)胞和 Hela 細(xì)胞凋亡的影響（藥物選取 IC50左右的濃度），計(jì)算果表明，C-Ur 和 EtoAc-P 均能夠明顯促進(jìn) MDA-MB-231 細(xì)胞和 H并且對 MDA-MB-231 細(xì)胞的促凋亡效果明顯優(yōu)于 Hela 細(xì)胞，提示 有一定的抗腫瘤選擇性和特異性（見圖 1-1、1-2，見表 1-4、1-5）

圖 1-2 C-Ur 和 EtoAc-P 對 Hela 細(xì)胞凋亡的影響表 1-4 C-Ur 和 EtoAc-P 對 MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡影響Ac-P 0 μg/mL 5 μg/mL期凋亡率 6.87% 0.22%期凋亡率 2.36% 42.98%凋亡率 9.23% 43.2%Ur 0 μM 12.5 μM期凋亡率 0.91% 30.43%期凋亡率 0.50% 1.99%凋亡率 1.41% 32.42%表 1-5 C-Ur 和 EtoAc-P 對 Hela 細(xì)胞的凋亡率

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本文編號：2736798