發(fā)布時(shí)間：2020-06-30 15:53

【摘要】：目的:本文基于微流控芯片技術(shù)篩選出鶴草藥材藥效物質(zhì)組分,并優(yōu)化仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分的提取純化工藝,同時(shí)建立仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),在此基礎(chǔ)上開(kāi)展仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分體外抗肝腫瘤藥效及作用機(jī)制研究,為中藥抗肺腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。方法:1.基于微流控芯片技術(shù),采用Hoechst 33342/PI熒光雙染法,以細(xì)胞凋亡壞死率為考察指標(biāo)進(jìn)行仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分篩選研究;以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為考察因素,總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化提取工藝條件;以樹(shù)脂型號(hào)、上樣濃度、上樣液pH值、洗脫溶劑用量等為考察因素,總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化純化工藝條件。2.采用HPLC法結(jié)合多波長(zhǎng)融合技術(shù)建立9種不同產(chǎn)地仙鶴草藥材藥效物質(zhì)指紋圖譜,并采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分的成分進(jìn)行解析,并采用高效液相色譜法對(duì)其中主要成分進(jìn)行多指標(biāo)成分定量研究,建立仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分綜合、全面、有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。3.采用微流控芯片技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分作用后肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡壞死、遷移及侵襲進(jìn)行研究,綜合評(píng)價(jià)其抗肝腫瘤藥效。4.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot相關(guān)技術(shù),分別從基因及蛋白質(zhì)水平探討仙鶴草藥材藥效物質(zhì)組分抗肝腫瘤的初步作用機(jī)制。結(jié)果:1.設(shè)計(jì)制作了一種多功能的高通量藥物篩選芯片,基于微流控芯片技術(shù)仙鶴草黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、生物堿、多糖顯示不同程度的體外抗肝癌作用:仙鶴草黃酮仙鶴草鞣質(zhì)仙鶴草生物堿仙鶴草多糖,藥效物質(zhì)組分仙鶴草總黃酮最佳提取工藝條件為1:16倍60%乙醇提取2次,每次1.5 h,總黃酮得率達(dá)10.68%,純度達(dá)46.13%;最佳純化工藝條件為采用D101型大孔吸附樹(shù)脂,以pH為5、0.2 mg/mL生藥濃度上樣,上樣量為0.6 g/mL(藥材/濕樹(shù)脂),上樣體積流量為2 BV/h上樣,4 BV水除,8 BV的60%乙醇2 BV/h體積流量進(jìn)行洗脫,總黃酮得率達(dá)4.19%,純度達(dá)91.71%。2.9種不同產(chǎn)地的仙鶴草黃酮類(lèi)組分之間存在一定差異,共分析鑒定出其10個(gè)化合物:槲皮素、山奈酚、槲皮苷、花旗松素、異槲皮苷、紫云英苷、兒茶素、芹菜素、野黃芩苷、鞣花酸,同時(shí)多指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的仙鶴草藥材黃酮化學(xué)成分含量差異較大,其中異槲皮苷含量最高的為江蘇常州,0.5386 mg·g~(-1);野黃芩苷含量最高的為安徽亳州,0.8316 mg·g~(-1);槲皮苷含量最高的為廣西南寧,0.4152 mg·g~(-1)。3.仙鶴草總黃酮類(lèi)組分對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2具有顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死作用,0.75 mg·mL~(-1)細(xì)胞凋亡壞死率達(dá)(67.97±1.9)%,對(duì)HepG2細(xì)胞周期具有顯著G2/M阻滯作用,同時(shí)基于設(shè)計(jì)制作的腫瘤細(xì)胞遷移侵襲模型芯片,仙鶴草總黃酮類(lèi)組分對(duì)HepG2細(xì)胞遷移侵襲顯示顯著抑制作用,且隨著給藥劑量的增加,藥效逐漸增強(qiáng),表現(xiàn)出較強(qiáng)抗肝腫瘤作用。4.PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:仙鶴草總黃酮能顯著上調(diào)PTEN、Caspase-3、Caspase-9基因的表達(dá),顯著下調(diào)PI3K、AKT、CyclinB1、CDC2、COX-2、VEGF基因的表達(dá),Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:仙鶴草總黃酮顯著降低了PI3K、AKT、VEGF、COX-2、CyclinB1蛋白的表達(dá),顯著升高了PTEN、Caspase-9蛋白的表達(dá),整合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù),分析仙鶴草總黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN-PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抗肝腫瘤藥效。結(jié)論:1.本課題結(jié)合軟光刻、模注法及等離子鍵合等技術(shù)構(gòu)建了兩種藥效研究芯片,一種為多功能的高通量藥物篩選芯片,可實(shí)現(xiàn)同種細(xì)胞多種藥物藥效的在線(xiàn)篩選,另一種為腫瘤細(xì)胞遷移侵襲模型芯片,實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲模型,為下一步仙鶴草藥效物質(zhì)抗肝腫瘤研究奠定基礎(chǔ),也為抗腫瘤藥物藥效研究提供新的技術(shù)平臺(tái)。2.本課題優(yōu)化了了仙鶴草總黃酮的提取純化方法,其工藝簡(jiǎn)單易于操作,為仙鶴草總黃酮的后續(xù)藥效研究奠定了一定基礎(chǔ)。3.本實(shí)驗(yàn)從仙鶴草總黃酮的指紋圖譜、成分分析及多指標(biāo)成分的定量多個(gè)角度出發(fā),采用HPLC及UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)相結(jié)合,建立仙鶴草總黃酮綜合、全面、有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系,為其開(kāi)發(fā)利用及藥效研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.仙鶴草總黃酮具有抑制HepG2細(xì)胞增殖、促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡、阻滯HepG2細(xì)胞周期、抑制HepG2細(xì)胞遷移侵襲的作用,具有顯著抗肝腫瘤藥效。5.仙鶴草總黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN-PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抗肝腫瘤藥效。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文72 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔，均勻分布六組，每組有 3 個(gè)復(fù)列，每列四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔，細(xì)胞培養(yǎng)腔由一條對(duì)應(yīng)的通道而連接。通過(guò)對(duì)該芯片中設(shè)計(jì)的不同位置入口的不同打孔方式，實(shí)現(xiàn)不同的液體流動(dòng)方式，可實(shí)現(xiàn) 6 種不同藥物或 6 種細(xì)胞藥效的在線(xiàn)篩選。

基于微流控芯片技術(shù)的仙鶴草抗肝腫瘤藥效物質(zhì)及初步作用機(jī)制研究亡壞死率，細(xì)胞凋亡壞死率%=（凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù)）/全部細(xì)胞數(shù)×100%，結(jié)果見(jiàn)表 1-2-1、圖 1-2-1。表 1-2-1 不同組分對(duì) HepG2 細(xì)胞凋亡壞死率的影響（x±s，n=3)組別 細(xì)胞凋亡壞死率（%)空白 1.02±0.20仙鶴草黃酮 59.77±0.41**仙鶴草鞣質(zhì) 52.39±0.79**仙鶴草生物堿 41.35±0.34**仙鶴草多糖 32.68±0.95**注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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本文編號(hào)：2735506