發(fā)布時間：2020-06-30 12:16

【摘要】：研究背景及目的:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以廣泛侵襲性的滑膜炎為特征的慢性自身免疫性疾病。在持續(xù)的炎癥細(xì)胞浸潤和滑膜細(xì)胞增殖的情況下,RA通過破壞關(guān)節(jié)、軟骨和骨骼的結(jié)構(gòu)和功能導(dǎo)致骨侵蝕性破壞、不可逆的關(guān)節(jié)損傷,甚至造成高度殘疾,進(jìn)而影響患者的健康。天然小分子化合物來源廣泛,結(jié)構(gòu)多樣,有望成為治療RA的潛在化學(xué)藥物。因此,對于尋求具有高效、低毒的的抗RA天然藥物顯得尤為迫切和重要。黃荊Vitex negundo L.(VN)為馬鞭草科牡荊屬藥用植物,其成熟果實黃荊子是一種民間廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥,主要功效為祛風(fēng)除濕和理氣止痛,多年來在民間用于治療RA。已有藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、止痛、抗氧化、抗腫瘤和抗骨質(zhì)疏松的潛在功效。我們前期研究發(fā)現(xiàn),黃荊子中主要的活性成分為木脂素活性成分(vitexdoins),獲得的總木脂素有效部位TOV(total vitexdoins)具有顯著的抗RA作用,TOV主要含有4個成分:VNL(VN1)、vitedoin A(VN2)、vitedoamine A(VN5)和vitexdoin A(VN12),但目前對于TOV中有效成分的作用機(jī)制均未闡明。因此,本課題選取了其中2個代表性成分VN5和VN2,采用多種炎癥及破骨細(xì)胞模型研究了VN5和VN2的體外抗RA作用及機(jī)制,為TOV候選藥物的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。方法:(1)采用CCK8檢測了VN5和VN2對293T細(xì)胞、RAW 264.7細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。(2)使用雙熒光素酶報告基因法測定了VN5和VN2在293T細(xì)胞中對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。(3)采用Griess試劑法測定了VN2,VN5對LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO含量的抑制作用。(4)將破骨細(xì)胞與不同濃度的VN2、VN5、MCSF(50ng/mL)和RANKL(100ng/mL)共培養(yǎng)4天,至成熟的破骨細(xì)胞形成。采用對硝基苯磷酸鹽測定成熟破骨細(xì)胞中總TRAP活性。(5)用TRAP染色法對成熟破骨細(xì)胞進(jìn)行染色,顯微鏡觀察TRAP陽性細(xì)胞數(shù)(超過3個細(xì)胞核)。除此之外將成熟的破骨細(xì)胞用羅丹明綴合的鬼筆環(huán)肽染色,并在熒光顯微鏡下觀察肌動蛋白環(huán)的結(jié)構(gòu)。(6)利用Western-blot研究了VN5和VN2對LPS/IL-1β/TNF-α刺激的RAW 264.7細(xì)胞、RANKL刺激的破骨細(xì)胞和IL-1β刺激的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中NF-κB和MAPK的炎癥信號通路的影響。通過Real-time RT-PCR檢測了VN5和VN2對IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子和破骨細(xì)胞標(biāo)志性的NFATc1、TRAP、CTSK基因的表達(dá)情況。(7)用IKKβ激酶活性光度法檢測VN5對RAW 264.7細(xì)胞的IKKβ活性的抑制作用;采用分子對接技術(shù)初步探究了VN5與其潛在作用靶點IKKβ的結(jié)合情況。結(jié)果:(1)木脂素活性成分VN5和VN2對不同細(xì)胞因子刺激的RAW264.7細(xì)胞的抗炎作用及機(jī)制研究。VN5可以劑量依賴性地抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中NO的含量,且在此濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細(xì)胞增殖沒有顯著性的抑制,同時下調(diào)了TNF-α刺激的293T細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性(p0.05)。但是,VN2對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性和NO含量沒有顯著的抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),VN5通過抑制p-IKK的表達(dá),可進(jìn)一步下調(diào)p-p65和p-ERK的表達(dá),顯著抑制LPS/IL-1β/TNF-α誘導(dǎo)的IκB降解,進(jìn)而抑制了NF-κB和MAPK信號通路的激活(p0.05)。同時,在LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中,VN5顯著降低了NF-κB下游炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)(p0.05)。(2)木脂素活性成分VN5和VN2對破骨細(xì)胞形成和功能的影響及作用機(jī)制研究。VN2和VN5,較RANKL刺激的模型組相比,均濃度依賴性地顯著降低了破骨細(xì)胞特征性標(biāo)志酶TRAP的活性(p0.05)。此外,在破骨細(xì)胞分化形成的過程中,模型組中可明顯觀察到TRAP陽性多核細(xì)胞。然而,在VN2和VN5不同劑量給藥情況下,尤其是在高濃度時,TRAP陽性多核細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(p0.05)。在破骨細(xì)胞功能的研究中,肌動蛋白環(huán)鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示,與對照組相比,VN2和VN5藥物處理后肌動蛋白環(huán)變細(xì),其周圍足體減少甚至消失,且VN2處理后對肌動蛋白環(huán)的影響比VN5更明顯。因此,本課題進(jìn)一步探究了其作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中,VN2給藥后顯著抑制了ERK的磷酸化,同時下調(diào)了NFATc1,及NFATc1調(diào)控的CTSK和TRAP磷酸化的表達(dá),而對NF-κB途徑中I?B?和p65的表達(dá)沒有影響。不同的是,VN5通過下調(diào)p-IKK的表達(dá),可同時抑制p-p65和p-ERK以及RANKL誘導(dǎo)的IκB降解,進(jìn)而抑制了NF-κB和MAPK信號通路的激活(p0.05)。Real-time RT-PCR檢測結(jié)果表明在VN2和VN5藥物組處理RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中,NFATc1以及NFATc1調(diào)控的CTSK、TRAP和OSCAR的mRNA表達(dá)水平顯著下降(p0.05)。(3)木脂素活性成分VN5對IL-1β刺激的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞的抗炎作用及機(jī)制和靶點研究。在IL-1β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中,VN5顯著抑制了NF-κB下游炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表達(dá)(p0.05),在蛋白水平上顯著抑制p-IKK的表達(dá),進(jìn)一步下調(diào)p-p65和p-ERK的表達(dá),進(jìn)而抑制了NF-κB和MAPK信號通路的激活(p0.05)。結(jié)合前面的研究結(jié)果,我們推測IKK可能是VN5抗RA的潛在靶點。因此,本課題進(jìn)一步探究了VN5對IKK的作用,發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中,VN5處理后顯著抑制了IKKβ活性,尤其是濃度為40μM時,抑制率可達(dá)48%。同時分子對接結(jié)果顯示,VN5可與Cys99和Asp103以氫鍵的形式結(jié)合。Cys99位于ATP活性口袋的中心,推測VN5可通過阻止ATP與IKKβ結(jié)合,發(fā)揮其抑制IKKβ的活性。結(jié)論:(1)VN5主要通過抑制炎癥反應(yīng)和緩解骨質(zhì)破壞發(fā)揮抗RA作用,作用機(jī)制是通過下調(diào)p-IKK蛋白表達(dá),抑制了IκBα降解和p-ERK的蛋白表達(dá),從而抑制NF-?B和MAPK信號通路的激活,IKK?可能是VN5抗RA的作用靶點;(2)VN2主要通過緩解關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞發(fā)揮抗RA作用,作用機(jī)制是通過干預(yù)ERK-NFATc1信號通路以及肌動蛋白環(huán)的形成來抑制破骨細(xì)胞的形成。我們的研究結(jié)果提示,黃荊子中的不同木脂素活性成分可協(xié)同起效,發(fā)揮抗RA作用。
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284;R285

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本文編號：2735299