【摘要】：研究背景及目的:類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以廣泛侵襲性的滑膜炎為特征的慢性自身免疫性疾病。在持續(xù)的炎癥細胞浸潤和滑膜細胞增殖的情況下,RA通過破壞關節(jié)、軟骨和骨骼的結構和功能導致骨侵蝕性破壞、不可逆的關節(jié)損傷,甚至造成高度殘疾,進而影響患者的健康。天然小分子化合物來源廣泛,結構多樣,有望成為治療RA的潛在化學藥物。因此,對于尋求具有高效、低毒的的抗RA天然藥物顯得尤為迫切和重要。黃荊Vitex negundo L.(VN)為馬鞭草科牡荊屬藥用植物,其成熟果實黃荊子是一種民間廣泛應用的傳統(tǒng)中藥,主要功效為祛風除濕和理氣止痛,多年來在民間用于治療RA。已有藥理學研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、止痛、抗氧化、抗腫瘤和抗骨質疏松的潛在功效。我們前期研究發(fā)現(xiàn),黃荊子中主要的活性成分為木脂素活性成分(vitexdoins),獲得的總木脂素有效部位TOV(total vitexdoins)具有顯著的抗RA作用,TOV主要含有4個成分:VNL(VN1)、vitedoin A(VN2)、vitedoamine A(VN5)和vitexdoin A(VN12),但目前對于TOV中有效成分的作用機制均未闡明。因此,本課題選取了其中2個代表性成分VN5和VN2,采用多種炎癥及破骨細胞模型研究了VN5和VN2的體外抗RA作用及機制,為TOV候選藥物的臨床前研究奠定基礎。方法:(1)采用CCK8檢測了VN5和VN2對293T細胞、RAW 264.7細胞、破骨細胞和成纖維細胞樣滑膜細胞的細胞增殖的影響。(2)使用雙熒光素酶報告基因法測定了VN5和VN2在293T細胞中對NF-κB的轉錄活性的抑制作用。(3)采用Griess試劑法測定了VN2,VN5對LPS刺激的RAW 264.7細胞上清液中NO含量的抑制作用。(4)將破骨細胞與不同濃度的VN2、VN5、MCSF(50ng/mL)和RANKL(100ng/mL)共培養(yǎng)4天,至成熟的破骨細胞形成。采用對硝基苯磷酸鹽測定成熟破骨細胞中總TRAP活性。(5)用TRAP染色法對成熟破骨細胞進行染色,顯微鏡觀察TRAP陽性細胞數(shù)(超過3個細胞核)。除此之外將成熟的破骨細胞用羅丹明綴合的鬼筆環(huán)肽染色,并在熒光顯微鏡下觀察肌動蛋白環(huán)的結構。(6)利用Western-blot研究了VN5和VN2對LPS/IL-1β/TNF-α刺激的RAW 264.7細胞、RANKL刺激的破骨細胞和IL-1β刺激的成纖維細胞樣滑膜細胞中NF-κB和MAPK的炎癥信號通路的影響。通過Real-time RT-PCR檢測了VN5和VN2對IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子和破骨細胞標志性的NFATc1、TRAP、CTSK基因的表達情況。(7)用IKKβ激酶活性光度法檢測VN5對RAW 264.7細胞的IKKβ活性的抑制作用;采用分子對接技術初步探究了VN5與其潛在作用靶點IKKβ的結合情況。結果:(1)木脂素活性成分VN5和VN2對不同細胞因子刺激的RAW264.7細胞的抗炎作用及機制研究。VN5可以劑量依賴性地抑制LPS刺激的RAW 264.7細胞中NO的含量,且在此濃度范圍內對RAW264.7細胞增殖沒有顯著性的抑制,同時下調了TNF-α刺激的293T細胞中NF-κB的轉錄活性(p0.05)。但是,VN2對NF-κB的轉錄活性和NO含量沒有顯著的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),VN5通過抑制p-IKK的表達,可進一步下調p-p65和p-ERK的表達,顯著抑制LPS/IL-1β/TNF-α誘導的IκB降解,進而抑制了NF-κB和MAPK信號通路的激活(p0.05)。同時,在LPS刺激的RAW 264.7細胞中,VN5顯著降低了NF-κB下游炎性細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(p0.05)。(2)木脂素活性成分VN5和VN2對破骨細胞形成和功能的影響及作用機制研究。VN2和VN5,較RANKL刺激的模型組相比,均濃度依賴性地顯著降低了破骨細胞特征性標志酶TRAP的活性(p0.05)。此外,在破骨細胞分化形成的過程中,模型組中可明顯觀察到TRAP陽性多核細胞。然而,在VN2和VN5不同劑量給藥情況下,尤其是在高濃度時,TRAP陽性多核細胞的數(shù)量明顯減少(p0.05)。在破骨細胞功能的研究中,肌動蛋白環(huán)鬼筆環(huán)肽染色結果顯示,與對照組相比,VN2和VN5藥物處理后肌動蛋白環(huán)變細,其周圍足體減少甚至消失,且VN2處理后對肌動蛋白環(huán)的影響比VN5更明顯。因此,本課題進一步探究了其作用機制,發(fā)現(xiàn)在RANKL誘導的破骨細胞中,VN2給藥后顯著抑制了ERK的磷酸化,同時下調了NFATc1,及NFATc1調控的CTSK和TRAP磷酸化的表達,而對NF-κB途徑中I?B?和p65的表達沒有影響。不同的是,VN5通過下調p-IKK的表達,可同時抑制p-p65和p-ERK以及RANKL誘導的IκB降解,進而抑制了NF-κB和MAPK信號通路的激活(p0.05)。Real-time RT-PCR檢測結果表明在VN2和VN5藥物組處理RANKL誘導的破骨細胞分化中,NFATc1以及NFATc1調控的CTSK、TRAP和OSCAR的mRNA表達水平顯著下降(p0.05)。(3)木脂素活性成分VN5對IL-1β刺激的類風濕性關節(jié)炎成纖維滑膜細胞的抗炎作用及機制和靶點研究。在IL-1β誘導的成纖維細胞樣滑膜細胞中,VN5顯著抑制了NF-κB下游炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表達(p0.05),在蛋白水平上顯著抑制p-IKK的表達,進一步下調p-p65和p-ERK的表達,進而抑制了NF-κB和MAPK信號通路的激活(p0.05)。結合前面的研究結果,我們推測IKK可能是VN5抗RA的潛在靶點。因此,本課題進一步探究了VN5對IKK的作用,發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的RAW264.7細胞中,VN5處理后顯著抑制了IKKβ活性,尤其是濃度為40μM時,抑制率可達48%。同時分子對接結果顯示,VN5可與Cys99和Asp103以氫鍵的形式結合。Cys99位于ATP活性口袋的中心,推測VN5可通過阻止ATP與IKKβ結合,發(fā)揮其抑制IKKβ的活性。結論:(1)VN5主要通過抑制炎癥反應和緩解骨質破壞發(fā)揮抗RA作用,作用機制是通過下調p-IKK蛋白表達,抑制了IκBα降解和p-ERK的蛋白表達,從而抑制NF-?B和MAPK信號通路的激活,IKK?可能是VN5抗RA的作用靶點;(2)VN2主要通過緩解關節(jié)骨質破壞發(fā)揮抗RA作用,作用機制是通過干預ERK-NFATc1信號通路以及肌動蛋白環(huán)的形成來抑制破骨細胞的形成。我們的研究結果提示,黃荊子中的不同木脂素活性成分可協(xié)同起效,發(fā)揮抗RA作用。
【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284;R285

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本文編號：2735299