發(fā)布時(shí)間：2020-06-30 10:55

【摘要】：近年來,心腦血管疾病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢(shì),其防治工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性血管炎癥性疾病,是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。免疫學(xué)說認(rèn)為巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜的遷移是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié),如果能抑制巨噬細(xì)胞向受損血管遷移,就能夠在對(duì)其免疫功能影響較小的情況下,實(shí)現(xiàn)AS的早期防治。中藥水蛭具有抗凝血、抗血栓和抗炎癥等多種活性,臨床上已被廣泛應(yīng)用于治療多種心腦血管疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)水蛭酶解物(Hirudo Extraction,HE)可以顯著性降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS斑塊面積及斑塊中巨噬細(xì)胞的數(shù)量,其作用機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜下層遷移有關(guān),因此,本課題在上述研究的基礎(chǔ)上計(jì)劃從HE中分離純化出具有抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移活性的多肽,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:1.抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移水蛭肽的分離純化與合成本實(shí)驗(yàn)采用酶解法從寬體金線蛭中制備得到水蛭酶解物HE。在建立LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移模型后,通過Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn)HE可以濃度依賴性抑制巨噬細(xì)胞遷移。接著使用Q Sepharose FF強(qiáng)堿性陰離子交換柱層析、Superdex 30、Superdex peptide和G10凝膠柱層析對(duì)HE進(jìn)行分離純化,并結(jié)合Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行活性追蹤,最終分離得到具有抑制巨噬細(xì)胞RA3W264.7遷移活性的水蛭肽HE4-1。經(jīng)HPLC和高分辨質(zhì)譜檢測,水蛭肽HE4-1純度為98%,分子量為1429.294 Da,氨基酸序列為EAGSAKELEGDPVAG。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示800 μg/mL合成水蛭肽HE-D同樣具有抑制巨噬細(xì)胞遷移活性。2.水蛭肽抑制巨噬細(xì)胞遷移作用機(jī)制研究研究顯示JNK和p38通路參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的遷移。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot探究HE-D對(duì)巨噬細(xì)胞JNK和p38蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示HE-D對(duì)JNK與p38總蛋白的表達(dá)量無顯著影響,但800 μg/mL的HE-D可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的JNK和p38磷酸化蛋白的升高,這表明HE-D可以通過調(diào)節(jié)JNK和p38磷酸化水平發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞遷移作用。3.水蛭肽對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能影響探究巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞。當(dāng)外源性微生物入侵機(jī)體后,巨噬細(xì)胞可以通過吞噬、溶解細(xì)菌和釋放促炎因子調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)。本課題通過中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)、溶菌酶活性測定實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測水蛭肽對(duì)巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)生物學(xué)功能的影響。結(jié)果顯示0-800 μg/mL的HE4-1和HE-D對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力、溶菌酶活性和對(duì)IL-1,IL-6,IL-12的分泌能力無顯著性影響,但400、800 μg/mL的HE4-1和HE-D可以促進(jìn)TNF-α的分泌。綜上所述,本課題首次從寬體金線蛭干體中分離純化得到一段序列為EAGSAKELEGDPVAG的多肽HE4-1,該多肽可通過抑制MAPK通路中JNK和p38磷酸化水平發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7遷移作用。此外,純化和合成水蛭肽均對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力、溶菌酶活性和IL-1,IL-6,IL-12的分泌能力無顯著性影響。本課題有可能為中藥水蛭在AS早期防治上的應(yīng)用提供新的理論支持。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

如本章２．邋１．３．２。逡逑物的制備及抑制巨噬細(xì)胞遷移活性檢測逡逑備逡逑法從１００邋ｇ寬體金線蛭干體粉末中提取得到水蛭酶Ｅ。逡逑毒性檢測逡逑法檢測ＨＥ在０－８００邋ｐｇ／ｍＬ范圍內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞ＲＡ顯示在該濃度范圍內(nèi)，ＨＥ對(duì)巨噬細(xì)胞的存活率無ＨＥ濃度確定為０＿８０（Ｈｉｇ／ｍＬ。逡逑

３．邋１．３邋ＨＥ抑制巨噬細(xì)胞遷移活性檢測逡逑３．邋１．３．邋１邋ＬＰＳ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ＲＡＷ２６４．７遷移模型的建立逡逑使用ＬＰＳ誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞ＲＡＷ２６４．邋７徖移模型。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ結(jié)果如圖２－２逡逑所示，１邋ｐｇ／ｍＬＬＰＳ可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞ＲＡＷ２６４．７的遷移，且遷移細(xì)胞數(shù)量逡逑適中，便于計(jì)數(shù)，因此選擇該濃度作為ＬＰＳ的最終造模濃度。逡逑：．、，tj＿邐Ｂ逡逑．＇Ｖ邋Ｖ邋：／邐１５０００－，逡逑焌：：媭海Ｉ廔輯詹§邐￡邐＊＊逡逑．ｊ

本文編號(hào)：2735224