甘油磷酸膽堿(Glycerophosphatidylcholine，GPC，alpha．GPC)是脂磷脂酰膽堿(PC)分子上的兩個(gè)脂肪�；�完全被水解掉的產(chǎn)物。藥物代謝動(dòng)力學(xué)表明：PC被吸收進(jìn)入血液循環(huán)，分布在各器官，它也是人體內(nèi)分泌代謝的水溶性小分子物質(zhì)，能通過(guò)血腦屏障，為重要的神經(jīng)傳遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetyl—choline)的生物合成前體。根據(jù)“膽堿能損傷假說(shuō)”，老年癡呆癥的發(fā)病機(jī)制(記憶力、認(rèn)知障礙等)與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平降低密切相關(guān)，如果提高腦內(nèi)乙酰膽堿水平，可以顯著改善老年癡呆患者認(rèn)識(shí)功能損傷的癥狀。有專利報(bào)道了甘油磷酸膽堿和茴拉西坦同時(shí)服用，可以治療阿爾茨海默氏癥。臨床研究表明：GPC治療腦缺血性中風(fēng)、阿爾茨海默氏癥、多發(fā)性腦梗死型癡呆療效顯著。臨床用于改善中毒性肝損傷等保肝作用 ；同時(shí)，GPC還具有顯著的防衰老、降血脂、健腦等多種功效，作為保健品及藥物制劑的研究與應(yīng)用正越來(lái)越受到重視。GPC已經(jīng)在意大利、波蘭、韓國(guó)、俄羅斯、希臘、智利、巴西等國(guó)家上市，可在我國(guó)，還處于研發(fā)階段。本試驗(yàn)，采用三氧化二鋁脫色法 和硅膠柱層析法 相結(jié)合的工藝對(duì)甘油磷酸膽堿進(jìn)行分離純化，并采用高效液相色譜法對(duì)其在強(qiáng)光照射、高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，從而為其生產(chǎn)、包裝、貯存、制劑研發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

　　1 儀器與試藥

　　1．1 主要儀器上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司SL202N型電子天平；長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司TGI6一WS臺(tái)式高速離心機(jī)；江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠HH一2型恒溫水浴鍋；美國(guó)ALLTECH2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，配備單島津液相LC一10ATVP輸液泵，六通閥手動(dòng)進(jìn)樣，浙江大學(xué)N2000色譜工作站。

　　1．2 主要試藥GPC粗品由合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室酶法生產(chǎn)；GPC對(duì)照品從意大利Euti．cals S．pA公司購(gòu)買；GPC產(chǎn)品(批號(hào)為100301，100302，100303)由本實(shí)驗(yàn)室分離純化制得。無(wú)水乙醇、甲醇、二氯甲烷均為天津四友公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭�，乙腈為天津四友公司生產(chǎn)的色譜純?cè)噭�，所用水為超純水機(jī)制備的去離子水；三氧化二鋁和硅膠粉均為100—200目，由國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。

　　2 方法與結(jié)果

　　2．1 甘油磷酸膽堿的層析純化

　　2．1．1 三氧化二鋁和硅膠粉的預(yù)處理 三氧化二鋁的預(yù)處理：將三氧化二鋁平鋪在容器中，于25O℃的烘箱中烘烤4 h待用；硅膠粉的預(yù)處理：將硅膠粉平鋪在容器中，于105℃的烘箱中烘烤30 min待用。

　　2．1．2 三氧化二鋁對(duì)甘油磷酸膽堿粗品脫色 選擇甘油磷酸膽堿與三氧化二鋁的質(zhì)量比為1：10。

　　在燒杯中稱取實(shí)驗(yàn)室制備的甘油磷酸膽堿約10 g，加入無(wú)水乙醇約100 mL，置于50℃的恒溫水浴鍋中保溫，攪拌，使得甘油磷酸膽堿完全溶解后，加入約100 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的三氧化二鋁，攪拌脫色2 h，離心分離，除去下層三氧化二鋁。將上層溶液蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到塑黃色的甘油磷酸膽堿4．2 g。

　　2．1．3 硅膠柱層析法進(jìn)一步純化甘油磷酸膽堿稱取約210 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的硅膠粉，用甲醇溶脹24h后，濕法裝柱。將經(jīng)過(guò)三氧化二鋁脫色的4．2 g甘油磷酸膽堿產(chǎn)品溶于少量乙醇中，小心的加入層析柱內(nèi)。緩慢的加入洗脫劑(甲醇：乙醇：氯仿=60：35：15)進(jìn)行洗脫，分段收集柱下端流出的洗脫液，檢測(cè)，合并含有甘油磷酸膽堿的洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到甘油磷酸膽堿產(chǎn)品。

　　2．2 甘油磷酸膽堿的含量測(cè)定及穩(wěn)定性研究

　　2．2．1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取意大利Euti．cals S．pA公司的GPC對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L的儲(chǔ)備液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2．2．2 色譜條件浙江大學(xué)N2000工作站，色譜柱為GraceSmart RP 8柱(250 mm×4．6 Bin，5I,zm)，流動(dòng)相為60％ 乙腈一水溶液，流速為0．7mL·min～，柱溫為(25-4-1)qC。檢測(cè)器為美國(guó)All—tech 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為109％ ，載氣為空氣，氣體流速為3．5 mL·min，進(jìn)樣量為20 L。

　　2．2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定分別精密吸取GPC對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、5、10、20 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容后，搖勻。精密量取20 L進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。對(duì)進(jìn)樣濃度(mg·L )和峰面積分別取對(duì)數(shù)，然后以濃度的對(duì)數(shù)lnC對(duì)甘油磷酸膽堿峰面積的對(duì)數(shù)y進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0．538 1lnC一8．722，R =0．999，線性范圍為100—2 000 mg·L～。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

　　通過(guò)圖1可以看出，硅膠柱層析后GPC在圖譜上表現(xiàn)為單峰。無(wú)論是從外觀上還是從HPLC譜圖上分析，都可以得出結(jié)論：通過(guò)硅膠柱層析能夠得到GPC純品。

　　2．2．4 樣品含量測(cè)定方法 精密稱取經(jīng)過(guò)分離純化的GPC適量，用流動(dòng)相溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L 的溶液。精密量取該溶液5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻。精密量取20 L進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，并采用外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算樣品含量。

　　2．2．5 回收率試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3、10 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容后，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱取分離純化的GPC(批號(hào)100301)適量，用流動(dòng)相溶解，分別制成約含GPC 0．4、0．5、0．6 g·L 的溶液各3份。精密量取20 L進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。采用外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算含量，并求得回收率。

　　平均回收率為99．81％ ；RSD=0．85％(n=9)。

　　2．2．6 精密度試驗(yàn)對(duì)照品溶液取“2．2．5”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液。精密稱取分離純化的GPC產(chǎn)品(批號(hào)100301)適量，用流動(dòng)相溶解，制成約含GPC 0．5g·L 的溶液。精密量取20 L進(jìn)樣，進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。采用外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算樣品含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果測(cè)得GPC的含量分另0為：99．02％ 、99．67％ 、100．14％ 、100．18％ 、99．28％ 、99．95％ ，平均含量為99．7l％ ，RSD =0．48％ (n=6)。

　　2．2．7 強(qiáng)光照射試驗(yàn) 取分離純化的GPC(批號(hào)100301)3份，編號(hào)為100301—1、100301—2、100301—3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5mm，置于澄明度測(cè)定儀下(光線強(qiáng)度為4 500 LX)10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。平均含量為99．51％；RSD=0．40％(凡=9)，結(jié)果表明含量無(wú)明顯變化，即GPC對(duì)光比較穩(wěn)定。