甘油磷酸膽堿(Glycerophosphatidylcholine，GPC，alpha．GPC)是脂磷脂酰膽堿(PC)分子上的兩個脂肪�；�完全被水解掉的產(chǎn)物。藥物代謝動力學表明：PC被吸收進入血液循環(huán)，分布在各器官，它也是人體內(nèi)分泌代謝的水溶性小分子物質(zhì)，能通過血腦屏障，為重要的神經(jīng)傳遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetyl—choline)的生物合成前體。根據(jù)“膽堿能損傷假說”，老年癡呆癥的發(fā)病機制(記憶力、認知障礙等)與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平降低密切相關，如果提高腦內(nèi)乙酰膽堿水平，可以顯著改善老年癡呆患者認識功能損傷的癥狀。有專利報道了甘油磷酸膽堿和茴拉西坦同時服用，可以治療阿爾茨海默氏癥。臨床研究表明：GPC治療腦缺血性中風、阿爾茨海默氏癥、多發(fā)性腦梗死型癡呆療效顯著。臨床用于改善中毒性肝損傷等保肝作用 ；同時，GPC還具有顯著的防衰老、降血脂、健腦等多種功效，作為保健品及藥物制劑的研究與應用正越來越受到重視。GPC已經(jīng)在意大利、波蘭、韓國、俄羅斯、希臘、智利、巴西等國家上市，可在我國，還處于研發(fā)階段。本試驗，采用三氧化二鋁脫色法 和硅膠柱層析法 相結(jié)合的工藝對甘油磷酸膽堿進行分離純化，并采用高效液相色譜法對其在強光照射、高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性進行研究，從而為其生產(chǎn)、包裝、貯存、制劑研發(fā)等提供科學依據(jù)。

　　1 儀器與試藥

　　1．1 主要儀器上海民橋精密科學儀器有限公司SL202N型電子天平；長沙湘儀離心機有限公司TGI6一WS臺式高速離心機；江蘇金壇晶玻實驗儀器廠HH一2型恒溫水浴鍋；美國ALLTECH2000蒸發(fā)光散射檢測器，配備單島津液相LC一10ATVP輸液泵，六通閥手動進樣，浙江大學N2000色譜工作站。

　　1．2 主要試藥GPC粗品由合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院實驗室酶法生產(chǎn)；GPC對照品從意大利Euti．cals S．pA公司購買；GPC產(chǎn)品(批號為100301，100302，100303)由本實驗室分離純化制得。無水乙醇、甲醇、二氯甲烷均為天津四友公司生產(chǎn)的分析純試劑，乙腈為天津四友公司生產(chǎn)的色譜純試劑，所用水為超純水機制備的去離子水；三氧化二鋁和硅膠粉均為100—200目，由國藥集團生產(chǎn)。

　　2 方法與結(jié)果

　　2．1 甘油磷酸膽堿的層析純化

　　2．1．1 三氧化二鋁和硅膠粉的預處理 三氧化二鋁的預處理：將三氧化二鋁平鋪在容器中，于25O℃的烘箱中烘烤4 h待用；硅膠粉的預處理：將硅膠粉平鋪在容器中，于105℃的烘箱中烘烤30 min待用。

　　2．1．2 三氧化二鋁對甘油磷酸膽堿粗品脫色 選擇甘油磷酸膽堿與三氧化二鋁的質(zhì)量比為1：10。

　　在燒杯中稱取實驗室制備的甘油磷酸膽堿約10 g，加入無水乙醇約100 mL，置于50℃的恒溫水浴鍋中保溫，攪拌，使得甘油磷酸膽堿完全溶解后，加入約100 g經(jīng)過預處理的三氧化二鋁，攪拌脫色2 h，離心分離，除去下層三氧化二鋁。將上層溶液蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到塑黃色的甘油磷酸膽堿4．2 g。

　　2．1．3 硅膠柱層析法進一步純化甘油磷酸膽堿稱取約210 g經(jīng)過預處理的硅膠粉，用甲醇溶脹24h后，濕法裝柱。將經(jīng)過三氧化二鋁脫色的4．2 g甘油磷酸膽堿產(chǎn)品溶于少量乙醇中，小心的加入層析柱內(nèi)。緩慢的加入洗脫劑(甲醇：乙醇：氯仿=60：35：15)進行洗脫，分段收集柱下端流出的洗脫液，檢測，合并含有甘油磷酸膽堿的洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到甘油磷酸膽堿產(chǎn)品。

　　2．2 甘油磷酸膽堿的含量測定及穩(wěn)定性研究

　　2．2．1 對照品溶液的制備精密稱取意大利Euti．cals S．pA公司的GPC對照品適量，用流動相溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L的儲備液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2．2．2 色譜條件浙江大學N2000工作站，色譜柱為GraceSmart RP 8柱(250 mm×4．6 Bin，5I,zm)，流動相為60％ 乙腈一水溶液，流速為0．7mL·min～，柱溫為(25-4-1)qC。檢測器為美國All—tech 2000型蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為109％ ，載氣為空氣，氣體流速為3．5 mL·min，進樣量為20 L。

　　2．2．3 標準曲線的測定分別精密吸取GPC對照品儲備液1、2、3、5、10、20 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相定容后，搖勻。精密量取20 L進樣，記錄色譜峰面積。對進樣濃度(mg·L )和峰面積分別取對數(shù)，然后以濃度的對數(shù)lnC對甘油磷酸膽堿峰面積的對數(shù)y進行線性回歸，求得標準曲線方程為：Y=0．538 1lnC一8．722，R =0．999，線性范圍為100—2 000 mg·L～。實驗結(jié)果見圖1。

　　通過圖1可以看出，硅膠柱層析后GPC在圖譜上表現(xiàn)為單峰。無論是從外觀上還是從HPLC譜圖上分析，都可以得出結(jié)論：通過硅膠柱層析能夠得到GPC純品。

　　2．2．4 樣品含量測定方法 精密稱取經(jīng)過分離純化的GPC適量，用流動相溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L 的溶液。精密量取該溶液5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻。精密量取20 L進樣，記錄色譜峰面積，并采用外標兩點對數(shù)法計算樣品含量。

　　2．2．5 回收率試驗分別精密吸取對照品儲備液3、10 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相定容后，搖勻，作為對照品溶液。精密稱取分離純化的GPC(批號100301)適量，用流動相溶解，分別制成約含GPC 0．4、0．5、0．6 g·L 的溶液各3份。精密量取20 L進樣，記錄色譜峰面積。采用外標兩點對數(shù)法計算含量，并求得回收率。

　　平均回收率為99．81％ ；RSD=0．85％(n=9)。

　　2．2．6 精密度試驗對照品溶液取“2．2．5”項下的對照品溶液。精密稱取分離純化的GPC產(chǎn)品(批號100301)適量，用流動相溶解，制成約含GPC 0．5g·L 的溶液。精密量取20 L進樣，進樣6次，記錄色譜峰面積。采用外標兩點對數(shù)法計算樣品含量，并計算相對標準偏差。結(jié)果測得GPC的含量分另0為：99．02％ 、99．67％ 、100．14％ 、100．18％ 、99．28％ 、99．95％ ，平均含量為99．7l％ ，RSD =0．48％ (n=6)。

　　2．2．7 強光照射試驗 取分離純化的GPC(批號100301)3份，編號為100301—1、100301—2、100301—3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5mm，置于澄明度測定儀下(光線強度為4 500 LX)10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。平均含量為99．51％；RSD=0．40％(凡=9)，結(jié)果表明含量無明顯變化，即GPC對光比較穩(wěn)定。