背景及目的納米氧化鋅(zinc oxide nanoparticles,ZnO-NPs)的廣泛應(yīng)用增加了職業(yè)人群在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用中的暴露機(jī)會。ZnO-NPs可通過多種途徑(呼吸道、消化道和皮膚滲透等)進(jìn)入機(jī)體,隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)至循環(huán)系統(tǒng),并隨血液流動遷移、蓄積,進(jìn)而誘導(dǎo)血管系統(tǒng)發(fā)生炎癥。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可以導(dǎo)致多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展,而ZnO-NPs能否導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷而誘導(dǎo)血管系統(tǒng)炎癥尚存爭議,仍需進(jìn)一步研究。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)可催化血紅素降解為膽紅素、亞鐵離子和一氧化碳,具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等功能,然而HO-1在ZnO-NPs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性中的作用尚未研究,有待進(jìn)一步探索。為探究ZnO-NPs能否誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)以及HO-1在該過程中的作用,本課題在體外實(shí)驗(yàn)水平上,探究ZnO-NPs對內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy 926的脂質(zhì)過氧化作用及炎性反應(yīng),并通過調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)水平,進(jìn)一步探討HO-1在ZnO-NPs致炎反應(yīng)中的作用,為研究ZnO-NPs對機(jī)體的心血管毒性作用提供理論依據(jù)。方法1.ZnO-NPs(質(zhì)量濃度0、2.5、5、10、15、20、25、30、40μg/mL)作用于EA.hy 926細(xì)胞24 h,CCK 8法測定ZnO-NPs對EA.hy 926細(xì)胞活性的影響。2.分別以0、2.5、5、10、15μg/mL的ZnO-NPs處理EA.hy 926細(xì)胞,采用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平,使用RT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-1β、VEGF、MCP-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平,ELISA方法檢測細(xì)胞分泌的IL-1β、VEGF蛋白表達(dá)水平,Western Blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平。3.使用HO-1激活劑鈷原卟啉(protoporphyrin IX cobalt chloride,CoPPIX)和HO-1抑制劑鋅原卟啉(protoporphyrin IX zinc,ZnPPIX)分別預(yù)處理細(xì)胞1 h后,以15μg/mL的ZnO-NPs對EA.hy 926細(xì)胞進(jìn)行染毒,檢測細(xì)胞HO-1表達(dá)水平、ROS水平、SOD活性、MDA含量及IL-1β、VEGF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.ZnO-NPs對EA.hy 926細(xì)胞活性的影響與對照組相比,當(dāng)ZnO-NPs濃度達(dá)到10μg/mL時(shí),細(xì)胞活性顯著降低,隨著ZnO-NPs濃度的增加,細(xì)胞活性呈逐漸降低的趨勢。ZnO-NPs濃度為15μg/mL時(shí),細(xì)胞活性為63.18%,而在20μg/mL時(shí),細(xì)胞活性為46.07%。2.ZnO-NPs對EA.hy 926細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用與對照組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平相比,染毒劑量5μg/mL、10μg/mL及15μg/mL組細(xì)胞ROS水平均有增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對照組細(xì)胞SOD活性相比,5μg/mL、10μg/mL及15μg/mL染毒組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),10μg/mL及15μg/mL染毒組細(xì)胞的MDA含量與對照相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,MDA生成增多,SOD活性逐漸降低,MDA/SOD比值升高,細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用。3.ZnO-NPs對EA.hy 926細(xì)胞的炎性作用ZnO-NPs處理細(xì)胞12 h后,細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6、VEGF、MCP-1 mRNA表達(dá)量相比對照組均有不同程度的升高,分泌的IL-1β、VEGF蛋白水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.ZnO-NPs對EA.hy 926細(xì)胞HO-1表達(dá)水平的影響在無應(yīng)激情況下,HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較低,隨著ZnO-NPs刺激劑量的增加,細(xì)胞內(nèi)HO-1相對表達(dá)水平隨之升高。與對照組相比較,10、15μg/mL ZnO-NPs染毒組HO-1 mRNA及HO-1蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與10μg/mL組相比較,15μg/mL組HO-1表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.改變細(xì)胞HO-1水平對細(xì)胞炎性的影響5.1激活HO-1表達(dá)對細(xì)胞的影響CoPPIX處理后,細(xì)胞HO-1表達(dá)水平顯著增高,CoPPIX+ZnO-NPs組相比于ZnO-NPs組,ROS水平、MDA含量及MDA/SOD比值明顯下降,SOD活性明顯增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CoPPIX+ZnO-NPs組相比于ZnO-NPs組,細(xì)胞分泌的IL-1β水平明顯下降,VEGF水平明顯增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.2抑制HO-1表達(dá)對細(xì)胞的影響ZnPPIX處理后,細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)水平明顯降低,ZnPPIX+ZnO-NPs組相比于ZnO-NPs組,ROS水平、MDA含量及MDA/SOD比值明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而SOD活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.50)。ZnPPIX+ZnO-NPs組相比于ZnO-NPs組,IL-1β水平明顯升高,VEGF水平明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.10、15μg/mL的ZnO-NPs可以誘導(dǎo)EA.hy 926細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用及炎性反應(yīng)。2.HO-1激活可以減輕ZnO-NPs所致的EA.hy 926細(xì)胞炎性反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：
ZnO-NPs對EA.hy926細(xì)胞活性的影響
ZnO-NPs對EA.hy926細(xì)胞ROS表達(dá)水平影響的熒光圖（40×）
ZnO-NPs對EA.hy926細(xì)胞ROS表達(dá)水平影響的流式細(xì)胞圖
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本文編號：
2862479
