塵肺病(pneumoconiosis)是由于長期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內(nèi)潴留而導(dǎo)致的以肺組織不可逆性纖維化為主的全身性疾病,是我國危害最嚴重、涉及人數(shù)最多的職業(yè)病,其中最常見的兩種類型是矽肺(silicosis)和煤工塵肺(coal workers’pneumoconiosis,CWP)。井下煤礦作業(yè)人群的煤工塵肺以混合性塵肺-煤矽肺為多見,占87.6%,單純的矽肺病和煤肺病很少,分別為11.4%和1.0%。2013年我國共報告了新增塵肺病例23152例,占全年新發(fā)職業(yè)病的87.72%,其中95.2%是矽肺病和煤工塵肺。塵肺病發(fā)生發(fā)展的病因、機制復(fù)雜,難以完全闡明,塵肺病一個重要的病理特征是,細胞外基質(zhì)大量沉積。其中層粘連蛋白是一類具有多功能域的基底膜非膠原糖蛋白,由α、β、γ鏈構(gòu)成的異三聚體,參與基底膜骨架的組裝,影響和調(diào)節(jié)細胞的粘附、遷移、分化、增殖等生物學(xué)行為,也參與細胞信號的傳導(dǎo)。層粘連蛋白β1鏈(LamB1)由LAMB1基因編碼,在體內(nèi)分布廣泛,參與組裝至少7種層粘連蛋白亞型。LamB1是肺發(fā)育和維持正常功能所必需的,也被報道參與腎、肝纖維化過程。然而,關(guān)于LamB1與塵肺的研究報道較少。雖然長期粉塵暴露是塵肺病的主要病因,但相同暴露條件下,發(fā)病率、病變進展快慢及纖維化嚴重程度的差異提示遺傳因素在塵肺的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。單核苷酸多態(tài)性是研究疾病遺傳易感性的重要工具,可反應(yīng)個體表型、疾病易感性及對藥物、環(huán)境等影響因素反應(yīng)的差異。前期對塵肺病進行的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS),發(fā)現(xiàn)在LAMB1基因上一個多態(tài)性位點rs4320486與塵肺病的發(fā)生危險性存在著相關(guān)性。鑒于塵肺病發(fā)病機制復(fù)雜,目前尚無有效治療,且缺乏人群特異的血清學(xué)指標,深入研究基因多態(tài)性與塵肺病間遺傳易感性的關(guān)系,對建立有效的易感性篩查,提高粉塵接觸人群的健康監(jiān)護水平都具有實際意義。目的在前期對塵肺病進行的全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwas)的基礎(chǔ)上,通過大樣本的病例-對照研究驗證lamb1rs4320486與塵肺病發(fā)生危險性間的關(guān)聯(lián);通過人群血清樣本、細胞模型研究rs4320486位點突變對lamb1基因轉(zhuǎn)錄表達的影響;通過動物模型和體外細胞模型觀察lamb1在纖維化過程中的動態(tài)變化及可能的調(diào)控機制,為揭示塵肺病發(fā)病機制、個性化預(yù)防及治療提供線索。方法(1)對1091例cwp患者和1042例無塵肺接塵對照進行問卷調(diào)查,包括一般人口學(xué)資料、接塵史、家族史等,并采集空腹外周靜脈血,采用taqman基因分型法對受試者基因進行分型;(2)構(gòu)建包含rs4320486(ct)不同等位基因的載體,建立細胞模型,采用雙熒光素酶報告基因發(fā)檢測不同等位基因?qū)amb1基因轉(zhuǎn)錄的影響;(3)采用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)檢測不同基因間、病例和對照間血清lamb1濃度;(4)收集正常人肺組織和纖維化人肺組織,qrt-pcr法檢測組織中l(wèi)amb1mrna表達水平的差異;(5)分別建立sio2和blm誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型,對處理后不同時間截點的小鼠肺組織病理切片進行he染色,觀察不同時間點肺纖維化發(fā)生發(fā)展情況,以確認模型成功建立;(6)分別提取各期小鼠肺組織蛋白和rna,檢測lamb1、上皮標志物e-cadherin、及間質(zhì)標志物α-sma蛋白及mrna水平的動態(tài)變化;(7)建立sio2處理hbe細胞模型和tgf-β1誘導(dǎo)nih-3t3細胞模型,誘導(dǎo)纖維化病變,通過westernblot和qrt-pcr法確認lamb1與上皮間質(zhì)標志物的表達情況,細胞免疫熒光直觀展示hbe、nih-3t3細胞中纖維化表達的變化;(8)通過抑制劑特異性阻斷活化的信號通路,研究纖維化中調(diào)控lamb1表達的機制。(9)應(yīng)用epidata對人群調(diào)查建立數(shù)據(jù)庫,spss16.0、stata12.0、plink1.07用于數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計分析。使用imagej進行westernblot條帶灰度值掃描,圖形由graphpad5.0軟件完成。結(jié)果1.采用logistic回歸分析,以cc基因型為參照,lamb1rs4320486ct/tt基因型可以顯著降低cwp的發(fā)生危險性(p=0.001),調(diào)整年齡、累積粉塵暴露量(cde)、吸煙后or值為0.74,95%ci為0.62~0.88。攜帶t等位基因的個體發(fā)生cwp的危險性是攜帶c等位基因個體的0.76倍(p0.001)。分層分析顯示,ct/tt基因型降低cwp發(fā)生危險性的保護性效應(yīng),在年齡68歲組、低cde組及吸煙組人群中更加明顯。此外,采用cox回歸分析不同基因型與cwp病例從接塵到發(fā)病間期的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)ct/tt基因型可以延緩cwp的發(fā)生(p0.001)。2.從細胞和人群兩個方面觀察分析不同等位基因?qū)amb1表達的影響。轉(zhuǎn)染rs4320486pgl3-c等位基因質(zhì)粒的細胞熒光素酶相對活性顯著高于轉(zhuǎn)染pgl3-t組細胞(p0.05),在hbe細胞中約為3.6倍,在mrc-5細胞中約1.2倍。此外,elisa檢測48例接塵人員血清lamb1濃度顯示,相同基因型下,病例組的血清濃度高于對照組;在同為病例或同為對照組中,cc基因型個體血清lamb1濃度均略高于ct/tt基因型個體。這些結(jié)果提示不同基因型會影響lamb1表達水平的。3.用qrt-pcr檢測肺組織中l(wèi)amb1的表達水平,發(fā)現(xiàn)cwp患者和特發(fā)性肺纖維化(ipf)患者肺組織中l(wèi)amb1的表達水平顯著高于正常人肺組織(p0.05),分別是對照的2.7倍和2.3倍。4.在建立的blm和sio2誘導(dǎo)的c57bl/6小鼠兩種肺纖維化模型中,小鼠肺組織lamb1與間質(zhì)標志物-α-sma的蛋白與mrna水平均隨著纖維化的發(fā)生發(fā)展呈進行性增高,而上皮細胞標志物-e-cadherin則呈下降趨勢。5.在sio2處理hbe和tgf-β1處理nih-3t3的細胞實驗中,進一步驗證了在肺組織中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果,處理后可觀察到lamb1的蛋白水平和mrna水平均顯著增加,且隨著處理時間的延長,一直保持高水平。細胞免疫熒光更直觀的展示,與對照組相比,兩個處理組lamb1的表達強度和范圍均增加。6.sio2處理hbe后pi3k-akt信號通路和tgf-β/smad信號通路中下游分子均有表達上調(diào)的趨勢,給予pi3k抑制劑ly294002和tgf-β受體1拮抗劑(tβri)ly2157299后,p-akt、p-smad2和smad2表達下調(diào),lamb1的蛋白水平也相應(yīng)減少,尤其是在ly2157299抑制劑組。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)lamb1基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點rs4320486的突變會降低cwp的發(fā)生危險性,也可延緩cwp發(fā)病進程,這與下調(diào)lamb1基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān);體內(nèi)動物實驗和體外細胞實驗顯示,隨著肺纖維化的發(fā)生發(fā)展,lamb1的蛋白和mrna表達水平均呈現(xiàn)逐步增加的趨勢,提示lamb1可能在塵肺病的發(fā)生發(fā)展機制中扮演著重要的角色,可能是一種潛在的診斷治療生物標志物和遺傳易感性標志物。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R135.2
【文章目錄】：縮略語
中文摘要
英文摘要
1. 前言
2. 材料與方法
3. 結(jié)果
4. 討論
5. 結(jié)論
參考文獻
綜述
參考文獻
碩士期間發(fā)表論文
致謝
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2851324
