發(fā)布時(shí)間：2020-11-19 12:50

　　 視神經(jīng)疾病等神經(jīng)性慢性致盲性眼病,目前尚無(wú)有效的治療方法,藥物治療仍是這些疾病的主要治療手段之一。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用的研究一直是眼科屆研究的重點(diǎn),由于眼球結(jié)構(gòu)的特殊性,視網(wǎng)膜給藥苦難重重,如何才能達(dá)到安全、持久、有效的視網(wǎng)膜給藥治療效果仍然是有待克服的難題。 近些年來(lái),眼內(nèi)蛋白緩釋給藥系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用從一定程度上克服了傳統(tǒng)給藥方式(如全身給藥、滴眼、局部注射等)藥物難以到達(dá)眼內(nèi)或難以達(dá)到持久、安全的藥效的不足。 研究證明,促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等均具有神經(jīng)保護(hù)作用,且價(jià)格相對(duì)便宜,具有很好的臨床應(yīng)用前景。本研究就乳酸/羥基乙酸共聚物[Poly(L-lactic-co-glycolic acid), PLGA]包裹的EPO緩釋微球注射到SD大鼠視神經(jīng)挫傷模型的玻璃體腔來(lái)探討這種緩釋系統(tǒng)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的可行性及長(zhǎng)效的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用。 第一部分促紅細(xì)胞生成素緩釋微球的制備和體外釋放實(shí)驗(yàn) 目的制備裝載EPO的PLGA緩釋微球(EPO-PLGA微球),并探討其體外EPO釋放曲線。 方法利用低溫誘導(dǎo)相分離方法制備EPO多糖微粒,然后用水包油-油包固法(Solid-in-oil-in-water method, S/O/W法)制備EPO-PLGA緩釋微球。ELISA法檢測(cè)所制備的EPO-PLGA緩釋微球EPO的釋放曲線。 結(jié)果S/O/W法制備的EPO-PLGA緩釋微球,表面光滑,粒徑在40-100μm之間,體外釋放第一天突釋小于10%,緩釋到第60天時(shí),釋放率可達(dá)80%以上,釋放持久穩(wěn)定,釋放曲線接近線性釋放。 結(jié)論S/O/W法制備的EPO-PLGA緩釋微球可以達(dá)到EPO的長(zhǎng)效線性緩釋作用,為進(jìn)一步探討EPO-PLGA緩釋微球的生物學(xué)藥效提供了依據(jù)。 第二部分促紅細(xì)胞生成素緩釋微球體外活性和安全性的評(píng)估 目的探討EPO-PLGA緩釋微球的體外活性,并對(duì)PLGA及其降解產(chǎn)物安全性進(jìn)行評(píng)估。 方法建立體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜組織三維立體培養(yǎng)系統(tǒng),取1—3天新生SD大鼠視網(wǎng)膜,選取旁中心區(qū)視網(wǎng)膜,切成0.5mm×0.5mm大小植片,培養(yǎng)其中,分四組：EPO組,EPO-PLGA組,PLGA組和對(duì)照組,分別加入EPO (1 IU/mL)、EPO-PLGA釋放液(含EPO 1 IU/mL)、空白PLGA釋放液,對(duì)照組不加。在倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)情況,取培養(yǎng)第6天進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果培養(yǎng)第6天后,從視網(wǎng)膜植片軸突再生的平均長(zhǎng)度和密度來(lái)看,與對(duì)照組相比,EPO和EPO-PLGA釋放液對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001)；而空白PLGA釋放液組與對(duì)照組間無(wú)明顯差別(p0.05)。 結(jié)論EPO-PLGA緩釋微球在制備和釋放過(guò)程中不影響EPO的生物學(xué)活性,且PLGA及其降解產(chǎn)物無(wú)明顯的組織細(xì)胞毒副作用。 第三部分促紅細(xì)胞生成素緩釋微球?qū)σ暽窠?jīng)挫傷大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-長(zhǎng)效保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的以視神經(jīng)挫傷大鼠為模型,探討促紅細(xì)胞生成素緩釋微球EPO-PLGA微球經(jīng)玻璃體腔注射對(duì)受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的長(zhǎng)效保護(hù)作用。 方法選取成年SD大鼠,分為五組：未治療組,EPO組,EPO-PLGA組,PBS組和PLGA組。建立視神經(jīng)挫傷模型。建模后,未治療組不予玻璃體腔注射,EPO組分別于即刻和造模后4周玻璃體腔內(nèi)注射EPO10IU (5μL), EPO-PLGA組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射EPO-PLGA緩釋微球20mg (5μL,含EPO 20 IU), PBS組分別于即刻和造模后4周給予玻璃體腔內(nèi)注射0.01M PBS (5μL), PLGA組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射空白PLGA微球20mg(5μL)。分別術(shù)后4周和8周處死大鼠,處死前5天DiI上丘逆標(biāo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Reinal Ganglion Cells, RGCs),視網(wǎng)膜鋪片觀察各組RGCs存活情況；視網(wǎng)膜切片TUNEL檢測(cè)各組分別在術(shù)后1天、5天、2周、4周RGCs的凋亡情況；免疫組化檢測(cè)各組分別在術(shù)后1天、5天、2周、4周視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glial Fibrilary Acid Protein, GFAP)的表達(dá)情況。 結(jié)果視網(wǎng)膜鋪片RGCs計(jì)數(shù)顯示,正常SD大鼠RGCs密度為2387.69±164.87(個(gè)/mm2)；術(shù)后4周,未治療組、EPO組、EPO-PLGA組、PBS組和PLGA組RGCs密度(個(gè)/mm2)分別為748.30±58.81、1418.52±154.91、1296.68±157.55、804.43±86.44和821.72±52.13；術(shù)后8周,未治療組、EPO組、EPO-PLGA組、PBS組和PLGA組RGCs密度(個(gè)/mm2)分別為532.74±35.14、1083.66±57.82、913.98±37.72、548.01±47.00和561.96±34.23；EPO組和EPO-PLGA組較未治療組具有明顯的RGCs保護(hù)作用,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P0.001),而EPO組和EPO-PLGA組間無(wú)明顯差異(P0.05)。視網(wǎng)膜切片TUNEL檢測(cè)顯示,術(shù)后1天、5天、2周、4周各組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層均可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，其中在術(shù)后1天、5天,EPO組和EPO-PLGA組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率顯著少于未治療組、PBS組及PLGA組,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),術(shù)后2周、4周后,各組間視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層的TUNEL陽(yáng)性率差異不明顯,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；而節(jié)細(xì)胞層DAPI染色顯示,術(shù)后5天、2周、4周各組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)EPO組和EPO-PLGA組均顯著多于未治療組、PBS組及PLGA組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。視網(wǎng)膜切片GFAP免疫組化顯示,術(shù)后5天、2周、4周,EPO和EPO-PLGA兩組中視網(wǎng)膜GFAP的表達(dá)量均顯著低于未治療組、PBS組及PLGA組,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論EPO-PLGA緩釋微球單次玻璃體腔注射能長(zhǎng)效保護(hù)大鼠視神經(jīng)挫傷引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷和丟失,效果等同于定期重復(fù)多次EPO玻璃體腔注射。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R774.1
【部分圖文】：

1EPO一PLGA微球形態(tài)5/0/w方法制備的EPO緩釋微球，表面光滑，粒徑在40一100林m之間，如圖所示(圖1)。圖1光學(xué)顯微鏡下EPO一PLGA緩釋微球形態(tài)外觀可見(jiàn)微球形狀圓，表面光滑，直徑在40一100林m之間 2EPO一PLGA緩釋微球體外釋放曲線 2.1EPO標(biāo)準(zhǔn)曲線EPO蛋白ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖(圖2)

2.2EPO一PLGA體外釋放曲線EPO多糖顆粒進(jìn)一步通過(guò)5/0/W制備方法包裹于PLGA微球中，所得EPO一PLGA緩釋微球第一天突釋小于10%，第60天釋放率達(dá)到80%以上，釋放持久、穩(wěn)定。其體外釋放曲線如圖所示(圖3)。n”︶n”n”O(jiān)QOnUnU八︸‘U泊，，自l心.衛(wèi)歲。s戈。一。J。A一祠.一Iunn口

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【參考文獻(xiàn)】

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1 李越,王雨生,惠延年;納米給藥系統(tǒng)在眼科的應(yīng)用[J];國(guó)際眼科雜志;2003年04期

2 貢亦清;陳逖;石春和;殷孝健;周敏;陳永東;;氟尿嘧啶脂質(zhì)體玻璃體注射防治增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究[J];眼外傷職業(yè)眼病雜志(附眼科手術(shù));2008年02期

3 畢宏生;崔彥;張建華;王興榮;解孝鋒;;5-氟尿嘧啶聚乳酸微球防治實(shí)驗(yàn)性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的效果觀察[J];中華眼科雜志;2006年01期

本文編號(hào)：2890031