發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 21:45

　　 背景:鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一,早期患者容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞與細(xì)胞的交互作用可能對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起到了極其重要的作用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),鼻咽癌高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)明顯促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphatic endothelial cell,LEC)的增殖,而LEC細(xì)胞條件培養(yǎng)基促使5-8F細(xì)胞的侵襲遷移能力增強(qiáng);通過兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移,特別是直接接觸培養(yǎng)尤為明顯。接著,我們通過分選型流式細(xì)胞儀將共培養(yǎng)后的兩種細(xì)胞分選出來分別與單獨(dú)培養(yǎng)的同種細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq及蛋白抗體芯片檢測,并通過生物信息學(xué)分析篩選了潛在的作用通路。根據(jù)分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)差異分子主要富集于TGF-β信號通路以及細(xì)胞粘附、細(xì)胞趨化因子、血管生成因子等方面,并且共培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)的miR-17-92等部分miRNA存在表達(dá)差異。目的:反復(fù)驗(yàn)證體外共培養(yǎng)條件下LEC與5-8F細(xì)胞的交互作用,同時(shí)驗(yàn)證共培養(yǎng)后的差異表達(dá)分子,并綜合分析其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的可能作用。方法:分別制備LEC與5-8F細(xì)胞培養(yǎng)24h后的條件培養(yǎng)基,將兩種細(xì)胞進(jìn)行條件培養(yǎng)基共培養(yǎng),然后通過Realtime-PCR和Western Blot方法檢測細(xì)胞中TGF-β及部分轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)情況;接著采用條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)和transwell共培養(yǎng)兩種方式進(jìn)行LEC和5-8F的共培養(yǎng),分別檢測細(xì)胞以及上清液中miR-17-92基因簇成員的表達(dá)情況;最后對miR-17-92進(jìn)行靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析。結(jié)果:1.采用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測CM共培養(yǎng)前后LEC和5-8F細(xì)胞中基因和蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后,LEC細(xì)胞中TGF-β以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子(CTGF、Fractalkine、DCN、IGF-2R、MIF)表達(dá)均降低了;而在5-8F細(xì)胞中表達(dá)均升高了。2.從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測E-cadherin的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CM共培養(yǎng)后LEC和5-8F細(xì)胞中表達(dá)均降低了,而β-catenin、MMP-9和Vimentin在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)均升高了。3.CM共培養(yǎng)后,5-8F和LEC細(xì)胞以及上清液中的大多數(shù)miR-17-92基因簇成員的表達(dá)升高了。4.在transwell共培養(yǎng)中,當(dāng)5-8F接種于下室,LEC接種于上室時(shí),共培養(yǎng)后這兩種細(xì)胞以及上清液中miR-17-92基因簇成員的表達(dá)均明顯升高了;而當(dāng)LEC接種于下室,5-8F接種于上室時(shí),共培養(yǎng)后這兩種細(xì)胞中miR-17-92基因簇成員的表達(dá)也均明顯升高,但共培養(yǎng)后的上清液中miR-17-92基因簇的大多數(shù)成員表達(dá)降低了。5.GO分析發(fā)現(xiàn),miR-17-92的預(yù)測靶基因主要參與了細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)展過程、細(xì)胞成分組織或生物起源等生物過程;KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn),靶基因顯著富集于內(nèi)吞作用通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、癌癥中的蛋白聚糖通路、非小細(xì)胞肺癌通路、PI3K-Akt信號通路、黏附連接、凋亡、TGF-beta信號通路等。結(jié)論:1.條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后,5-8F細(xì)胞中的TGF-β通路部分關(guān)鍵基因上調(diào),可能是其遷移能力增強(qiáng)的原因之一,而共培養(yǎng)后LEC細(xì)胞中的TGF-β通路部分關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào),可能促進(jìn)了LEC的增殖。2.鼻咽癌細(xì)胞5-8F可刺激LEC細(xì)胞分泌miR-17-92,而miR-17-92基因簇的上調(diào)可能與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生相關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

共培養(yǎng)后細(xì)胞中基因表達(dá)情況

2.2 條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)前后細(xì)胞中的蛋白表達(dá)檢測利用 Western Blot 方法檢測條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)前后細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖1-2所示，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后，與對照組相比LEC細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β2（p<0.05）、CTGF、Fractalkine（p<0.05）、DCN、IGF-2R（p<0.05）、MIF、E-cadherin 表達(dá)均降低了；在 5-8F 細(xì)胞中 TGF-β1（p<0.05）、TGF-β2、CTGF、Fractalkine（p<0.05）、DCN、IGF-2R（p<0.05）、MIF 表達(dá)均升高了，而 E-cadherin 雖然表達(dá)有下降的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WB結(jié)果均與 Realtime-PCR 結(jié)果 致。圖 1-2 共培養(yǎng)后細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況Figure 1-2 The expression of protein in cells after co-cultured by western blot.3 討論鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之 ，尤其是廣東和廣西等地發(fā)病率很高。大多數(shù)患者初診時(shí)就發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，NPC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不但影響了治療計(jì)劃和臨床分期，同時(shí)也影響了患者的療效和預(yù)后。NPC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前還不是十分清楚，因此深入探討 NPC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律

49圖 2-4 transwell 共培養(yǎng)后 LEC 細(xì)胞中 miRNA 表達(dá)情況Figure 2-4 Expression of miRNA in LEC cells after transwell co-culture. LEC_low, LEC is planted in thelower chamber; LEC_up, LEC is planted in the upper chamber.
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本文編號：2889239