發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 01:33

　　 HCV基因組編碼的NS3是一種具有多種生物學(xué)活性的非結(jié)構(gòu)蛋白,它具有絲氨酸蛋白酶、RNA螺旋酶和NTP酶活性。NS3絲氨酸蛋白酶在NS4A的輔助下在HCV自身NS3/NS4A/NS4B/ NS5A/NS5B等位點(diǎn)進(jìn)行切割,對于HCV蛋白的加工成熟過程具有重要作用。NS3/4A還參與HCV逃避宿主固有免疫系統(tǒng)的應(yīng)答,為HCV的持續(xù)慢性感染提供條件。NS3/4A絲氨酸蛋白酶可以切割宿主TLR3和RIG-I信號通路中重要的信號分子,通過切割TRIF適配子使TRIF不能招募TBKI從而封閉TLR3信號途徑,阻斷TLR3介導(dǎo)的IFNβ基因啟動子活化;在鄰近線粒體結(jié)構(gòu)域的508位Cys切割MAVS,破壞MAVS的線粒體定位,抑制RIG-I信號通路誘導(dǎo)的IRF-3的磷酸化及IFNβ活化,從而阻斷干擾素抗病毒作用。可見NS3/4A是一種多功能分子,抑制其活性既可以阻斷HCV的復(fù)制、翻譯及翻譯后蛋白加工成熟,又能使干擾素充分發(fā)揮其抗HCV作用效果。因此對其生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)成為發(fā)展抗HCV病毒藥物的重要策略之一,NS3/4A絲氨酸蛋白酶成為目前抗HCV病毒治療研究的主要靶位。近年來靶向HCV NS3/4A抑制劑的研究取得可喜的進(jìn)展,但由于缺乏合適的動物模型來對這些藥物的抗HCV作用效果進(jìn)行評價(jià),極大的延緩了這些藥物進(jìn)入臨床。 對此,本課題的研究目的是建立HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶活性體內(nèi)外監(jiān)測體系,并以該監(jiān)測體系為基礎(chǔ)評價(jià)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑的作用效果,為新型抗HCV藥物進(jìn)入臨床提供基礎(chǔ)資料。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 第一部分活體熒光成像實(shí)時(shí)監(jiān)測HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶活性 HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶可切割HCV NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B等自身位點(diǎn),參與HCV蛋白的加工成熟過程。本研究采用熒光素酶重組與互補(bǔ)策略,建立了活體熒光成像實(shí)時(shí)監(jiān)測HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶活性的細(xì)胞和動物模型。我們構(gòu)建了帶螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, Fluc)報(bào)告基因的載體ANlu(c△NS5A/B)BCluc,將Fluc分成NFluc和CFluc兩個(gè)片段,使其處于低活性狀態(tài)。NFLuc和CFLuc的兩端分別與兩個(gè)可緊密結(jié)合的小分子多肽A肽和B肽相連,形成ANFLuc和BCFLuc。ANFLuc和BCFLuc的中間由NS3/4A的切割位點(diǎn)NS5A/B相連形成報(bào)告基因ANluc(△NS5A/B)BCluc。當(dāng)其與NS3/4A共表達(dá)時(shí),NS3/4A在ANluc(△NS5A/B)BCluc的NS5A/B位點(diǎn)發(fā)生蛋白水解作用,使ANFLuc和BCFLuc分離,通過A肽和B肽的緊密結(jié)合作用使NFluc和CFluc重新組合形成完整的Fluc,恢復(fù)其熒光素酶活性。 在細(xì)胞水平將ANluc(△NS5A/B)BCluc與NS3/4A共轉(zhuǎn)染或?qū)⑵滢D(zhuǎn)染到HCV復(fù)制細(xì)胞中,使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶的活性。結(jié)果表明報(bào)告基因與NS3/4A共轉(zhuǎn)染或HCV復(fù)制細(xì)胞中的NS3/4A都對載體ANluc(△NS5A/B)BCluc發(fā)生了切割作用,使熒光素酶活性上調(diào)。通過水動力轉(zhuǎn)染法將ANluc(△NS5A/B)BCluc與NS3/4A表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi),活體熒光成像監(jiān)測熒光素酶活性,得到了與細(xì)胞水平類似的結(jié)果。隨后,我們使用幾種NS3/4A特異的shRNA或不同濃度的IFN-α抑制NS3/4A活性,發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性被抑制,熒光素酶活性與NS3/4A的表達(dá)量成正比。因此,ANluc(△NS5A/B)BCluc報(bào)告基因載體可在細(xì)胞和動物水平指示NS3/4A絲氨酸蛋白酶的活性。使用此監(jiān)測體系可用來進(jìn)行HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑的作用效果評價(jià)。 第二部分基于NS3/4A切割MAVS的特性建立HCV絲氨酸蛋白酶活性監(jiān)測細(xì)胞模型 HCV作為一種RNA病毒,能夠有效激活宿主固有免疫系統(tǒng)中IFN誘導(dǎo)信號通路,但同時(shí)HCV又通過拮抗天然免疫系統(tǒng)識別,干擾IFN信號通路以及抑制IFN刺激基因活化等多水平逃逸機(jī)制來逃避宿主的抗病毒活性。MAVS為IFN信號通路中一個(gè)非常重要的信號分子,HCV NS3/4A可在鄰近線粒體結(jié)構(gòu)域的508位Cys切割MAVS,破壞MAVS的線粒體定位,抑制RIG-I信號通路誘導(dǎo)的IFN-β活化。在本研究中,利用NS3/4A絲氨酸蛋白酶切割MAVS的特性,以eYFP及SEAP為報(bào)告基因,基于eYFP-MAVS激活I(lǐng)FNβ-SEAP的信號通路,建立了一個(gè)高靈敏的NS3/4A絲氨酸蛋白酶活性監(jiān)測細(xì)胞模型。正常情況下,帶有eYFP報(bào)告基因的eYFP-MAVS定位于細(xì)胞線粒體上,可激活I(lǐng)FN-β啟動子介導(dǎo)的SEAP的表達(dá)。共表達(dá)NS3/4A時(shí),eYFP-MAVS被水解,其定位由線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿中,從而阻斷了eYFP-MAVS對IFNβ-SEAP的激活作用。研究證明SEAP活性的下降與NS3/4A蛋白酶的表達(dá)量成正比。使用IFN-α處理HCV復(fù)制細(xì)胞,NS3/4A的表達(dá)量下降,SEAP活性上調(diào)。隨后,我們使用此報(bào)告基因體系對CsA和CsAIFN-α聯(lián)合用藥的抗HCV活性進(jìn)行了分析,證明此體系可用于抗HCV藥物的篩選。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R512.63
【文章目錄】：
縮略語索引
中文摘要
英文摘要
前言
    參考文獻(xiàn)
第一部分 活體熒光成像實(shí)時(shí)監(jiān)測HCV NS3/4A 絲氨酸蛋白酶活性
    實(shí)驗(yàn)材料
    實(shí)驗(yàn)方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第二部分 基于NS3/4A 切割 MAVS 的特性建立 HCV 絲氨酸蛋白酶活性監(jiān)測細(xì)胞模型
    實(shí)驗(yàn)材料
    實(shí)驗(yàn)方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3/4A的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡歷
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Eliane F Meurs;Adrien Breiman;;The interferon inducing pathways and the hepatitis C virus[J];World Journal of Gastroenterology;2007年17期

本文編號：2892313