研究目的： 通過體內外研究幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori, Hp)感染對胃黏膜上皮細胞增殖活性、p53及PUMA蛋白表達的影響,分析它們之間相互關系,從而在體內外探討Hp對胃黏膜上皮細胞的影響及其機制,為Hp相關疾病的治療提供新的靶點和方向。 研究方法： 1.臨床研究部分：對在我院(2007年1月-2009年9月)行胃鏡檢查的153例未行Hp根除治療的患者,取其內鏡活檢的胃黏膜病變組織進行研究。153例病變包括慢性非萎縮性胃炎(CNAG) 37例,慢性化生性萎縮性胃炎(CAG伴IM)39例,異型增生(DYS)39例,胃癌(GC)38例。應用免疫組化PV-9000法染色及(Giemsa染色檢測胃黏膜病變中突變型p53、PUMA蛋白的表達和Hp感染情況。 2.體外實驗分組如下：(1)根據NCTC11637Hp上清液濃度進行分組,分為A、B、C、D四組,濃度分別為11mg/ml,5.55mg/ml,2.775mg/ml,1.3875 mg/ml;(2)根據NCTC11639 Hp上清液濃度進行分組,分為A、B、C、D四組,濃度分別為7.5mg/ml,3.75mg/ml,1.875mg/ml,0.9375 mg/ml;(3)以Hp培養(yǎng)液為陰性對照組。各組作用GES-1細胞時間均為24h、48h、72h,用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),噻唑藍(MTT)檢測細胞生長的抑制率,蛋白質印跡(Western Blot)技術檢測p53、PUMA蛋白的表達。 研究結果： 1.臨床研究部分 (1)不同胃黏膜病變組織中突變型p53的表達對Hp陽性的CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組的突變型p53進行比較,各組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)；對Hp陰性的CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組的突變型p53進行比較,其中DYS、GC組顯著高于CNAG組(P0.05), DYS、GC組顯著高于CAG伴IM組(P0.05)；在同一病變中Hp陽性組突變型p53陽性表達一般高于Hp陰性組,突變型p53在CAG伴IM組有顯著差異(P0.05)。 (2)不同胃黏膜病變組織中PUMA的表達對Hp陽性的不同胃黏膜病變組織PUMA蛋白進行比較,隨病變進展,其PUMA蛋白表達逐漸下降,CNAG組與CAG伴IM、GC組有統(tǒng)計學差異(P0.001-0.05),DYS組與CAG伴IM、GC組有統(tǒng)計學差異(P0.01-0.05)；對Hp陰性的不同胃黏膜病變組織的PUMA蛋白進行比較,隨病變進展,其PUMA蛋白表達逐漸下降,其中CNAG組與DYS、GC組有統(tǒng)計學差異(P0.01-0.05),CAG伴IM及DYS組與GC組有統(tǒng)計學差異(P0.001)；在同一病變中Hp陽性組PUMA陽性表達一般低于Hp陰性組,PUMA在CAG伴IM組有顯著差異(P0.01)。 (3)對Hp陽性的CNAG、CAG伴IM、DYS組突變型p53與PUMA蛋白的表達行相關性分析,相關系數分別為0.032,-0.222,-0.012,P0.05；對Hp陰性的CNAG、CAG伴IM、Dys組突變型p53與PUMA蛋白的表達行相關性分析,相關系數分別為-0.142,0.221,0.041,P0.05。 2.體外研究部分 (1)形態(tài)學變化：在倒置顯微鏡下觀察到兩種菌株作用GES-1細胞48小時后形態(tài)學上都呈現典型的凋亡改變。 (2)不同基因型Hp培養(yǎng)上清液對GES-1細胞活性的影響 ①據NCTC11637Hp培養(yǎng)上清濃度的不同,24h、72h時,A、B、C、D組的生長抑制率顯著高于對照組(P0.001),在48h時,A、B、C組的生長抑制率顯著高于對照組(P0.001),但對照組與D組之間無顯著差異(P0.05)；24h、48h、72h時,A組的生長抑制率顯著高于B、C、D組(P0.001),其中48h、72h時,B組高于C、D組(P0.05),C組顯著高于D組(P0.001),24h時,B、C、D組之間無顯著差異(P0.05)。②根據作用時間的不同,NCTC11637Hp培養(yǎng)上清作用時間對GES-1細胞生長的抑制作用的影響表明,在11mg/ml、5.55mg/ml、2.775mg/ml、1.3875 mg/ml濃度范圍內Hp培養(yǎng)上清作用時間對GES-1細胞的生長抑制有顯著差異(P0.001)。在實驗A組,72h組的抑制作用均顯著高于24h、48h組(P0.001),但24h與48h之間無顯著差異(P0.05)；在實驗B組和C組,48h和72h的抑制作用均顯著高于24h組(P0.001-0.05),但48h和72h組之間無顯著差異(P0.05)；在實驗D組,24h、48h和72h組之間均無顯著差異(P0.05)。③和對照組相比,各實驗組的生長抑制率高于對照組,并且隨著濃度的增加NCTC11639Hp培養(yǎng)上清對GES-1細胞生長的抑制作用大都增強。24h時,實驗A、B組的生長抑制率顯著高于對照組(P0.001),但對照組與C、D組無顯著差異(P0.05),在48h、72h,A、B、C組的生長抑制率顯著高于對照組(P0.001-0.05),對照組與D組無統(tǒng)計學差異(P0.05)；24h,48h、72h, A組顯著高于B、C、D組(P0.001-0.05),其中24h、48h,B組高于C、D組(P0.05),C組與D組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),72h,B組高于D組(P0.001),C組顯著高于D組(P0.001),B、C組之間無顯著差異(P0.05)。④根據NCTC11639Hp培養(yǎng)上清作用時間的不同,在7.5mg/ml、3.75mg/ml、1.875mg/ml、0.9375 mg/ml濃度范圍內Hp培養(yǎng)上清作用時間對GES-1細胞的生長有抑制作用。在實驗A組,48h和72h組的抑制作用均顯著高于24h組(P0.001),48h和72h組之間無顯著差異(P0.05)；在實驗B組,72h組的抑制作用顯著高于24h組(P0.05),但48h與24h、72h組之間無顯著差異(P0.05)；在實驗C組,72h組的抑制作用顯著高于24h、48h組(P0.001-0.05),24h和48h組之間無顯著差異(P0.05)；在實驗D組,24h、48h、72h組之間均無顯著差異(P0.05) (3)不同基因型Hp培養(yǎng)上清液對p53、PUMA蛋白表達的影響 ①2.775mg/mlNCTC11637毒力上清作用GES-1細胞48h后p53蛋白上調(P0.001-0.01),而3.75mg/mlNCTC11639毒力上清作用GES-1細胞48h后p53蛋白無顯著變化(P0.05)。②3.75mg/mlNCTC11639毒力上清作用GES-1細胞48h后PUMA蛋白下調(P0.01-0.05),2.775mg/mlNCTC11637毒力上清作用GES-1細胞48h后無顯著變化(P0.05)。 結論： 1.突變型p53與PUMA蛋白的異常表達參與了胃黏膜癌變的發(fā)生,可能和Hp的早期致病作用有關。 2.不同基因型的Hp培養(yǎng)上清液均能以時間和濃度依賴的方式抑制胃黏膜上皮細胞生長,并誘導細胞凋亡,這可能是Hp導致胃黏膜損傷的機制之一。 3.不同基因型的Hp培養(yǎng)上清液對胃黏膜上皮細胞內p53的蛋白表達影響不同,這可能和菌株毒力不同有關。 4.不同基因型的Hp培養(yǎng)上清液對胃黏膜上皮細胞內PUMA的蛋白表達影響不同,這可能和菌株毒力不同有關。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R57
【部分圖文】：
53KDa注:圖3一10:l:實驗組NeTell637組ps3蛋白表達;2:實驗組NeTcll639組p53蛋白表達;3:對照組P53蛋自表達。3.2.3.2不同基因型即培養(yǎng)上清液對PuM^蛋白表達的影響表3一n不同基因型Hp培養(yǎng)上清作用GEs一1細胞后PuMA蛋自表達的比較(n=6)組別實驗組(48h)NCTCll637毒力上清 0.7921士0.29對照組(48h) 0.9756切.37P值卜 0.957 P>0.05NCTCll639毒力上清 0.3595士0.41 0.975肚0.0.37拼 2.721 P<0.05由表3一11可見，3.75哩/mlNCTCll639毒力上清作用GEs一l細胞48h后PuMA蛋白下調，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。
ACtin43KDa注:圖3一:1:實驗組NCTCll637組內參:2:實驗組NCTCll639組內參;3:對照組內參。53KDa注:圖3一10:l:實驗組NeTell637組ps3蛋白表達;2:實驗組NeTcll639組p53蛋白表達;3:對照組P53蛋自表達。3.2.3.2不同基因型即培養(yǎng)上清液對PuM^蛋白表達的影響表3一n不同基因型Hp培養(yǎng)上清作用GEs一1細胞后PuMA蛋自表達的比較(n=6)組別實驗組(48h)NCTCll637毒力上清 0.7921士0.29對照組(48h) 0.9756切.37P值卜 0.957 P>0.05NCTCll639毒力上清 0.3595士0.41 0.975肚0.0.37拼 2.721 P<0.05由表3一11可見，3.75哩/mlNCTCll639毒力上清作用GEs一l細胞48h后PuMA蛋白下調，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。
ACtin43KD8注:圖3一12:1:實驗組 NCTC11637組內參表達:2:實驗組NCTCll639組內參表達;3:對照組內參表達。23KDa注:圖3一13:1:實驗組 NCTC11637組PUMA蛋自表達;2:實驗組NCTCll639組PUMA蛋白表達;3:對照組PUMA蛋自表達。3.3討論 3.3.1不同基因型HP培養(yǎng)上清液對GES一1細胞增殖活性的影響自從1953年認厄仃en和Marshall首次發(fā)現Hp以來，已經發(fā)現Hp感染與胃炎，消化性潰瘍的發(fā)生密切相關，同時也是胃赫膜相關淋巴樣組織(Gastri。mucosa一ass。。iatedl卿 pheidtissueMALT)淋巴瘤及胃癌等疾病的重要致病因素[40]，Hp單獨作用可誘導蒙古沙土鼠胃癌的發(fā)生。目前Hp感染確切的致病機制仍不明確，全世界大約有一半以上人口感染Hp，只有10%一20%會發(fā)展為消化性潰瘍，1%一2%有發(fā)展為胃癌的風險[50，””2]
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2890077
