目的:探討兔角膜基質(zhì)細(xì)胞(CSCs)體外移植兔角膜后的存活時(shí)間。方法:體外培養(yǎng)原代兔CSCs,并行細(xì)胞免疫組化鑒定,利用慢病毒載體(LV)攜帶標(biāo)記基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)染兔CSCs,倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光強(qiáng)度,體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為2組,實(shí)驗(yàn)組行LV-EGFP標(biāo)記的兔CSCs細(xì)胞懸液角膜基質(zhì)注射,對(duì)照組等量生理鹽水角膜基質(zhì)注射,轉(zhuǎn)染后1wk,1mo取材冰凍切片觀察移植的CSCs熒光,石蠟切片行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織形態(tài)。結(jié)果:LV-EGFP轉(zhuǎn)染兔CSCs在倒置熒光顯微鏡下24h后可見少量熒光,96h和110h熒光較強(qiáng),轉(zhuǎn)染后的CSCs與正常CSCs細(xì)胞形態(tài)無明顯差異;轉(zhuǎn)染后1wk,1mo實(shí)驗(yàn)組中角膜基質(zhì)層中可見綠色熒光,對(duì)照組中無綠色熒光;石蠟切片1wk實(shí)驗(yàn)組見明顯上皮細(xì)胞增生及角膜輕微水腫,少量炎癥細(xì)胞浸潤,轉(zhuǎn)染后1mo實(shí)驗(yàn)組上皮細(xì)胞增生減弱,未見角膜層水腫;對(duì)照組1wk,1mo均未見明顯異常。結(jié)論:LV-EGFP標(biāo)記的兔CSCs行體外角膜基質(zhì)移植,可在角膜中至少存活1mo,且與鄰近組織相容性較好。

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【部分圖文】：

圖5冰凍切片(×100)

圖4兔角膜基質(zhì)注射圖(均為右眼)3討論

圖1兔CSCs原代培養(yǎng)(×100)

原代分離兔CSCs,部分細(xì)胞24h即可貼壁,7d后即可見細(xì)胞散落在培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞呈梭形,胞核居中,胞漿清亮,10d后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右,未見上皮或其它雜質(zhì)細(xì)胞,兔CSCs以1∶2～1∶3傳代,3d即可傳1代(圖1)。波形蛋白免疫組化結(jié)果:在培養(yǎng)出的細(xì)胞中陽性表達(dá),胞漿為棕色....

圖2兔CSCs波形蛋白免疫組化(×200)

圖1兔CSCs原代培養(yǎng)(×100)圖3不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的兔CSCs(×100)

圖3不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的兔CSCs(×100)

圖2兔CSCs波形蛋白免疫組化(×200)熒光倒置顯微鏡下觀察兔CSCs,吸出病毒液后24h后可見少量綠色熒光,隨著時(shí)間的延長,熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),連續(xù)觀察48、72、96、110h時(shí)間點(diǎn),發(fā)現(xiàn)96h和110h時(shí)熒光強(qiáng)度在倒置顯微鏡下較前增強(qiáng),但兩者無明顯差異,考慮96h時(shí)間短,....

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