發(fā)布時間：2020-11-22 06:35

　　 目的:阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是一種常見的呼吸睡眠疾病,以反復(fù)上氣道塌陷及慢性間歇低氧為主要特點。上氣道的穩(wěn)定開放主要依賴于上氣道負(fù)壓及神經(jīng)肌肉調(diào)控的平衡,其中頦舌肌起著至關(guān)重要的作用。在健康人群中,頦舌肌通過舌下神經(jīng)接受上游中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。這種調(diào)控作用已被證明可受到快動眼(Rapid Eye Movement,REM)期睡眠及低氧的影響。由于長期處于低氧狀態(tài),清醒時OSA患者的頦舌肌及其中樞調(diào)控常表現(xiàn)為代償性的活性增加,以對抗上氣道塌陷。但進(jìn)入REM睡眠期后,這種代償活性的消失將導(dǎo)致OSA患者的上氣道較健康人群更容易塌陷,從而進(jìn)一步加重病情,造成惡性循環(huán)。在睡眠期舌下神經(jīng)核上的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)與去甲腎上腺素均可影響舌下神經(jīng)的活性,且去甲腎上腺素可能占到了作用的90%。本實驗小組曾就此進(jìn)行了一系列研究,來探討在常氧及慢性間歇低氧條件下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的5-HT與去甲腎上腺素參與頦舌肌調(diào)控的潛在機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),中縫核上的5-羥色胺能神經(jīng)元可參與介導(dǎo)慢性間歇低氧誘導(dǎo)的頦舌肌運動皮層易化。向舌下神經(jīng)核中微注射α_1腎上腺素能受體阻斷劑可使頦舌肌的經(jīng)顱磁刺激(Transcranial magnetic stimulation,TMS)反應(yīng)明顯下降,提示我們?nèi)ゼ啄I上腺素可通過舌下神經(jīng)核上的α_1受體為頦舌肌的中樞調(diào)控提供正向的去甲腎上腺素能驅(qū)動。而慢性間歇低氧可使這種驅(qū)動效應(yīng)明顯加強(qiáng)。以上結(jié)論均提示我們,慢性間歇低氧所介導(dǎo)的頦舌肌中樞調(diào)控中,去甲腎上腺素起到了非常重要的作用。中縫核上的5-HT能神經(jīng)元通過激動舌下神經(jīng)核上的5-HT_(2A)受體來激活舌下神經(jīng)及頦舌肌。我們由此猜測,舌下神經(jīng)核上的去甲腎上腺素同樣來源于上游去甲腎上腺素能神經(jīng)元。并且此神經(jīng)元同樣可以參與慢性間歇低氧大鼠頦舌肌的中樞調(diào)控。解剖證據(jù)表明,舌下神經(jīng)核上分布的去甲腎上腺素能纖維末梢主要來源于位于腦干A5、LC、A7等去甲腎上腺素能細(xì)胞群,其中A7具有最大的投射傾向及比例。細(xì)胞膜上可與去甲腎上腺素結(jié)合的受體稱為腎上腺素能受體,屬于G蛋白耦連受體。研究表明,A7去甲腎上腺能神經(jīng)元上主要表達(dá)α_2腎上腺素能受體。作為一種自身受體,α_2腎上腺素能受體主要分布于突觸前,可負(fù)反饋調(diào)節(jié)神經(jīng)元去甲腎上腺素釋放。G蛋白門控的內(nèi)向整流鉀通道(G protein-gated inwardly rectifying postassium,GIRK)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布,通常參與調(diào)解神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后的抑制效應(yīng),可受去甲腎上腺素等多種神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控。免疫印跡實驗結(jié)果表明,A7細(xì)胞群存在GIRK通道陽性表達(dá)。由此我們可提出假設(shè),A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元可參與頦舌肌的中樞調(diào)控,可通過GIRK通道受神經(jīng)元上的α_2腎上腺素能受體(α_2受體)調(diào)節(jié)。慢性間歇低氧已被證明可參與介導(dǎo)頦舌肌的中樞代償。但去甲腎上腺素如何參與慢性間歇低氧大鼠的中樞調(diào)控,尚無明確定論。本研究課題旨在通過建立慢性間歇低氧模型大鼠來模擬臨床OSA患者反復(fù)間歇低氧的特點。在低氧的不同時間點,通過觀察大鼠頦舌肌肌電圖(Electromyogram,EMG)、TMS反應(yīng)及相關(guān)受體的變化等,來探討慢性間隙低氧A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元對頦舌肌中樞調(diào)控的作用及機(jī)制,進(jìn)而為OSA患者的臨床診斷與治療提供新的理論依據(jù)。方法:1.在常氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元及α_2受體與GIRK通道對頦舌肌的中樞調(diào)控的影響。在本實驗部分中,我們選取SPF級健康成年Wistar雄性大鼠,隨機(jī)分為常氧組(NO組,n=8)、IgG-SAP給藥組(IgG組,n=8)、Anti-DBH-SAP給藥組(SAP組,n=8)、NACL給藥組(NACL組,n=8)、Clonidine給藥組(CLO組,n=8)、RS-79948給藥組(RS組,n=8)、ML297給藥組(ML組,n=8)、Tertiapin-Q給藥組(TER組,n=8)、Tertiapin-Q/Clonidine給藥組(TC組,n=8)與ML297/RS-79948給藥組(MR組,n=8)。參考既往文獻(xiàn),通過免疫組化及免疫熒光明確去甲腎上腺素能神經(jīng)元在腦中的分布,利用瓊脂糖凝膠模型模擬藥物在腦內(nèi)的擴(kuò)散,通過腦立體定位儀進(jìn)行A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元定位。將特異性去甲腎上腺素能神經(jīng)元損傷劑Anti-DBH-SAP、α_2受體激動劑Clonidine、α_2受體阻斷劑RS-79948、GIRK通道激動劑ML297與GIRK通道阻斷劑Tertiapin-Q分別微量注射入相應(yīng)實驗組大鼠的A7細(xì)胞群。另有實驗大鼠被分別給予同等劑量IgG-SAP或NACL作為對照組。待大鼠恢復(fù)后,應(yīng)用經(jīng)顱磁刺激在特定時間點測量頦舌肌的TMS與EMG結(jié)果,來驗證常氧條件下A7去甲腎上腺能神經(jīng)元及α_2受體與GIRK通道對大鼠頦舌肌中樞調(diào)控的影響。2.慢性間歇低氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元及α_2受體對頦舌肌的中樞調(diào)控的影響及可能機(jī)制探討。在本實驗部分中,我們選取SPF級健康成年Wistar雄性大鼠,建立慢性間歇低氧(Chronic Intermittent Hypoxia,CIH)模型。實驗大鼠每天于8:00 AM-4:00 PM置于低氧艙共8小時,以7天為一周期,持續(xù)4個周期共28天。每次缺氧-復(fù)氧循環(huán)時間為188s,艙內(nèi)氧濃度呈周期波動于10%至21%之間。慢性間歇低氧大鼠被隨機(jī)分為單純慢性間歇低氧組(CIH組,n=32)、IgG-SAP給藥組(CIH+IgG組,n=8)、Anti-DBH-SAP給藥組(CIH+SAP組,n=8)、Clonidine給藥組(CIH+CLO組,n=8)、RS-79948給藥組(CIH+RS組,n=8)、NACL給藥組(CIH+NACL組,n=8)。參考既往文獻(xiàn),通過立體定位技術(shù),將特異性去甲腎上腺素能神經(jīng)元損傷劑Anti-DBH-SAP注射入CIH-SAP組大鼠的A7細(xì)胞群。α_2受體激動劑Clonidine、α_2受體阻斷劑RS-79948在實驗進(jìn)行當(dāng)天被分別注射進(jìn)入CIH-CLO與CIH-RS組大鼠的A7細(xì)胞群。另有實驗大鼠被分別給予同等劑量IgG-SAP或NACL作為對照組。待大鼠恢復(fù)后,在每一低氧周期結(jié)束當(dāng)天,即低氧的第7、14、21、28天,應(yīng)用經(jīng)顱磁刺激在特定時間點測量頦舌肌的TMS與EMG結(jié)果,來驗證慢性間歇低氧條件下A7細(xì)胞群去甲腎上腺能神經(jīng)元及其上α_2受體對大鼠頦舌肌中樞調(diào)控的影響。另有CIH組大鼠在每一低氧周期結(jié)束當(dāng)天被處死,進(jìn)行腦組織灌流取材及標(biāo)本切片,進(jìn)行冰凍切片免疫組化。比較低氧不同時間點A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元多巴胺-β-羥化酶(Dopamineβ-hydroxylase,DBH)、舌下神經(jīng)核去甲腎上腺素能纖維末梢、α_1受體及α_2受體蛋白的表達(dá)情況。以此來探討慢性間歇低氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元對頦舌肌的中樞調(diào)控影響的可能機(jī)制。結(jié)果:1.在常氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元及α_2受體與GIRK通道對頦舌肌的中樞調(diào)控的影響1.1在常氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元參與了頦舌肌的中樞調(diào)控,并起正向調(diào)控作用。當(dāng)損傷A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元時,可導(dǎo)致頦舌肌EMG活性下降,TMS潛伏期變長且振幅下降(p0.05)。1.2在常氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元上的α_2受體參與了頦舌肌的中樞調(diào)控,并起負(fù)向調(diào)控作用。當(dāng)激動A7細(xì)胞群α_2受體時,可導(dǎo)致頦舌肌EMG活性下降,TMS潛伏期變長且振幅下降。反之亦然(p0.05)。1.3在常氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元上的GIRK通道參與了頦舌肌的中樞調(diào)控,并起負(fù)向調(diào)控作用。當(dāng)激動A7細(xì)胞群GIRK通道時,可導(dǎo)致頦舌肌EMG活性下降,TMS潛伏期變長且振幅下降。反之亦然(p0.05)。1.4在常氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元α_2受體對頦舌肌中樞調(diào)控的功能是與GIRK通道耦聯(lián)的(p0.05)。2.慢性間歇低氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元及α_2受體對頦舌肌的中樞調(diào)控的影響及可能機(jī)制探討2.1在慢性間歇低氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元參與了頦舌肌的中樞調(diào)控,并起正向調(diào)控作用。這種正向調(diào)控作用持續(xù)28天。當(dāng)損傷A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元時,可導(dǎo)致頦舌肌TMS潛伏期變長且振幅下降,EMG活性下降(p0.05)。2.2在慢性間歇低氧條件下,大鼠A7細(xì)胞群的去甲腎上腺素能神經(jīng)元上的α_2受體參與了頦舌肌的中樞調(diào)控,并起負(fù)向調(diào)控作用。這種負(fù)向調(diào)控作用持續(xù)28天。當(dāng)激動A7細(xì)胞群α_2受體時,可導(dǎo)致頦舌肌TMS潛伏期變長且振幅下降,EMG活性下降。反之亦然(p0.05)。2.3慢性間歇低氧可增加A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元的DBH表達(dá)平均光密度值(p0.05),未影響DBH陽性細(xì)胞數(shù)目(p0.05)。2.4慢性間歇低氧增加了去甲腎上腺素能纖維膨體末梢數(shù)目(p0.05),但未影響舌下神經(jīng)核上去甲腎上腺素能纖維末梢DBH的表達(dá)的平均光密度值p0.05)。2.5慢性間歇低氧可增加舌下神經(jīng)核的α_(1A)受體表達(dá)的平均光密度值(p0.05),但未影響陽性細(xì)胞數(shù)目(p0.05)。2.6慢性間歇低氧可減少舌下神經(jīng)核的α_(2A)受體表達(dá)的平均光密度值(p0.05),但未影響陽性細(xì)胞數(shù)目(p0.05)。結(jié)論:1.在常氧條件下,A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元通過α_2受體與GIRK通道參與頦舌肌的中樞調(diào)控。2.在慢性間歇低氧條件下,A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元正向參與頦舌肌的中樞調(diào)控,作用持續(xù)28天。3.慢性間歇低氧影響A7細(xì)胞群DBH、舌下神經(jīng)核去甲腎上腺素能纖維末梢、α_(1A)受體及α_(2A)受體的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R766
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :常氧大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元對頦舌肌中樞調(diào)控的影響及機(jī)制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑和儀器
            2.2.1 主要試劑
            2.2.2 主要儀器
        2.3 溶液和藥物配制
            2.3.1 麻醉劑
            2.3.2 免疫組化實驗溶液
            2.3.3 實驗藥物
        2.4 實驗方法
            2.4.1 經(jīng)顱磁刺激記錄
            2.4.2 頦舌肌肌電記錄
            2.4.3 腦部擴(kuò)散模型的制備
            2.4.4 A7細(xì)胞群定位
            2.4.5 A7細(xì)胞群損毀
            2.4.6 A7細(xì)胞群微量注射
            2.4.7 組織取材及切片
            2.4.8 A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元免疫組織化學(xué)染色步驟
            2.4.9 A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元免疫熒光染色步驟
            2.4.10 A7細(xì)胞群DBH與 GIRK通道免疫熒光雙標(biāo)染色步驟
            2.4.11 中性紅染色步驟
            2.4.12 統(tǒng)計學(xué)方法
    3 結(jié)果
        3.1 實驗大鼠一般情況觀察
        3.2 常氧大鼠A7細(xì)胞群神經(jīng)元免疫熒光及免疫組化
        3.3 腦部藥物擴(kuò)散模擬結(jié)果
        3.4 微量注射部位標(biāo)記
        3.5 A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元特異性損傷
        3.6 A7細(xì)胞群GIRK通道的免疫熒光雙染
        3.7 損傷A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元后對頦舌肌的影響
2受體對頦舌肌中樞調(diào)控的影響'>        3.8 A7細(xì)胞群α₂受體對頦舌肌中樞調(diào)控的影響
        3.9 A7細(xì)胞群GIRK通道對頦舌肌中樞調(diào)控的影響
2受體對頦舌肌中樞調(diào)控的功能與GIRK通道耦連'>        3.10 A7細(xì)胞群α₂受體對頦舌肌中樞調(diào)控的功能與GIRK通道耦連
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 :慢性間歇低氧大鼠A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元對頦舌肌中樞調(diào)控的影響及機(jī)制研究
    6 前言
    7 材料和方法
        7.1 實驗動物
        7.2 主要試劑及儀器
            7.2.1 主要試劑
            7.2.2 主要儀器
        7.3 溶液和藥物配制
        7.4 實驗方法
            7.4.1 慢性間歇低氧模型大鼠制備
            7.4.2 經(jīng)顱磁刺激記錄
            7.4.3 頦舌肌肌電記錄
            7.4.4 A7細(xì)胞群損毀
            7.4.5 A7細(xì)胞群微量注射
            7.4.6 組織取材及切片
            7.4.7 A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元免疫組織化學(xué)染色步驟
            7.4.8 舌下神經(jīng)核去甲腎上腺素能纖維末梢免疫組織化學(xué)染色步驟
1A與α_2A受體免疫組織化學(xué)染色步驟'>            7.4.9 舌下神經(jīng)核α_1A與α_2A受體免疫組織化學(xué)染色步驟
            7.4.10 統(tǒng)計學(xué)方法
    8 結(jié)果
        8.1 實驗大鼠一般情況觀察
        8.2 慢性間歇低氧條件下?lián)p傷A7細(xì)胞群去甲腎上腺素能神經(jīng)元后對頦舌肌中樞調(diào)控的影響
2受體對頦舌肌中樞調(diào)控的影響'>        8.3 慢性間歇低氧條件下A7細(xì)胞群α₂受體對頦舌肌中樞調(diào)控的影響
        8.4 慢性間歇低氧對大鼠A7細(xì)胞群DBH表達(dá)的影響
        8.5 慢性間歇低氧對大鼠舌下神經(jīng)核去甲腎上腺素能纖維末梢的影響
1A受體表達(dá)的影響'>        8.6 慢性間歇低氧對大鼠舌下神經(jīng)核α_1A受體表達(dá)的影響
2A受體表達(dá)的影響'>        8.7 慢性間歇低氧對大鼠舌下神經(jīng)核α_2A受體表達(dá)的影響
    9 討論
    10 結(jié)論
    本研究的創(chuàng)新性及自我評價
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊銳;賈強(qiáng);馬善峰;郭曉磊;高琴;劉小粉;;G蛋白門控的內(nèi)向整流鉀通道在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)控機(jī)制及功能研究進(jìn)展[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2015年03期

本文編號：2894284