目的:分離、培養(yǎng)并鑒定飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(Small incision lenticule extraction,SMILE)來源人眼角膜成纖維細胞。探究體外機械性壓力(Mechanical compression)不同加載強度及加載時間對人眼角膜成纖維細胞的細胞形態(tài)、增殖與凋亡、基質(zhì)合成與降解等生命活動中相關(guān)分子表達水平的影響。方法:SMILE手術(shù)獲取人角膜基質(zhì)透鏡,I型膠原酶(Collagenase I)消化、體外分離培養(yǎng)人眼角膜成纖維細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),免疫熒光染色檢測細胞波形蛋白(Vimentin)表達以鑒定細胞類型。建立體外細胞機械性壓力刺激模型,對人眼角膜成纖維細胞給予不同壓力梯度(Agar+0g、Agar+1g、Agar+2g、Agar+4g、Agar+8g、Agar+16g、Agar+24g、Agar+32g),不同加載時長(6h、24h、48h)的機械性壓力刺激。倒置顯微鏡觀察人眼角膜成纖維細胞在不同機械性壓力刺激下形態(tài)學的變化。免疫熒光BrdU染色比較人眼角膜成纖維細胞在不同機械性壓力刺激前后增殖水平的變化。免疫熒光Annexin V/PI染色比較人眼角膜成纖維細胞在不同機械性壓力刺激下細胞凋亡水平的變化。qRT-PCR檢測細胞基質(zhì)合成和降解相關(guān)基因mRNA的表達水平,檢測主要指標包括:基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員MMP1、MMP9,其拮抗蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族成員TIMP1、TIMP2、TIMP3,角膜結(jié)構(gòu)性蛋白相關(guān)基因α1-1型膠原(Collagen type I alpha 1 chain,Col1a1)、光蛋白聚糖(Lumican)、Vimentin等。結(jié)果:1、通過膠原酶消化法可從SMILE手術(shù)來源的角膜基質(zhì)透鏡組織中快速獲得并培養(yǎng)人眼角膜成纖維細胞,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)呈長梭形或不規(guī)則三角形,符合角膜成纖維細胞特性,免疫組織熒光染色Vimentin表達陽性,明確體外培養(yǎng)所獲得細胞為角膜成纖維細胞,無角膜上皮細胞及角膜內(nèi)皮細胞等污染。2、成功建立機械性壓力刺激模型,并對人眼角膜成纖維細胞施加梯度機械性壓力刺激,觀察顯示相對低加載強度、相對短加載時間條件下的細胞仍可維持其固有形態(tài)特征,隨壓力加載強度增大和加載時間延長,Agar+32g組刺激6h、Agar+16g組刺激48h、Agar+24g組刺激48h細胞出現(xiàn)顯著形態(tài)改變,細胞形體變大,胞質(zhì)突起變短變粗,細胞核變大,部分細胞內(nèi)可見核固縮。3、免疫熒光BrdU染色結(jié)果顯示,機械性壓力加載8h后空白對照組(CON組)與Agar+0g組細胞的BrdU陽性細胞比例無顯著差異,Agar+8g組細胞的BrdU陽性細胞比例較CON組顯著降低,說明機械性壓力刺激可顯著抑制人眼角膜成纖維細胞增殖。免疫熒光Annexin V/PI染色結(jié)果顯示,機械性壓力加載8h后Agar+8g組較CON組細胞的Annexin V染色陽性細胞比例升高,PI染色陽性細胞比例升高,說明機械性壓力刺激可促進人眼角膜成纖維細胞凋亡。4、qRT-PCR檢測角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)分子mRNA結(jié)果顯示,機械性壓力刺激6h時MMP1、MMP9的基因表達顯著升高,TIMP1、Lumican表達輕度升高,TIMP3表達顯著降低,余基因表達未見明顯差異。機械性壓力刺激24h時,MMP1出現(xiàn)隨壓力梯度增長表達量上調(diào)的趨勢,Col1a1則出現(xiàn)隨壓力梯度增長表達量下調(diào)的相反趨勢,MMP9仍在多個壓力組中有明顯升高,余基因表達未見明顯差異。機械性壓力刺激48h時,MMP1仍可見表達量上調(diào),此外Col1a1、Vimentin、Lumican等角膜結(jié)構(gòu)性蛋白mRNA表達出現(xiàn)顯著下調(diào),余基因表達未見明顯差異,說明機械壓力會對角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應影響。結(jié)論:1、通過SMILE手術(shù)來源的角膜基質(zhì)透鏡組織加以膠原酶消化以培養(yǎng)細胞,是獲得充足、純化的正常原代人眼角膜成纖維細胞的有效方式。2、對人眼角膜成纖維細胞施加梯度機械性壓力刺激,隨壓力加載強度增大和加載時間延長,細胞將失去其固有形態(tài)特征。3、人眼角膜成纖維細胞的增殖與凋亡明顯會受到機械性壓力刺激的影響。4、機械性壓力短時間加載可促進人眼角膜成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員MMP1、MMP9的表達,長時間加載可抑制角膜結(jié)構(gòu)性蛋白Col1a1、Lumican、Vimentin的表達,進而參與影響人角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R77
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文原代培養(yǎng)第 1 天，倒置顯微鏡下觀察可見角膜成纖維細胞已貼壁，約半數(shù)細胞呈長梭形，半數(shù)細胞呈圓形或橢圓形，中央有卵圓形細胞核（圖 1.1-A）；原代培養(yǎng)第 3 天，所有細胞呈長梭型或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)突起，生長呈放射狀（圖 1.1-B）；原代培養(yǎng)第 5 天，可見細胞進一步倍增，生長密度達 90%以上，達到傳代培養(yǎng)所需密度（圖 1.1-C）。

成纖維細胞原代培養(yǎng)生長情況養(yǎng)第 1 天，細胞已貼壁，呈長梭形（黑色箭頭）或橢圓形（，細胞呈長梭形或不規(guī)則三角形，放射狀生長；C：原代培 90%以上。（標尺=100μm）纖維細胞免疫熒光鑒定至第 5 代，Vimentin 免疫熒光染色，胞漿中可見紅色所培養(yǎng)的原代細胞為角膜成纖維細胞（圖 1.2）。

機械性壓力施加示意圖；C：12 孔細胞培養(yǎng)板加壓后實物圖2.1.2.2 倒置顯微鏡觀察記錄細胞施加機械性壓力前，在培養(yǎng)板每孔中央?yún)^(qū)域記號筆標記固定位點，倒置顯微鏡下觀察并拍照。待細胞機械性壓力刺激實驗所需時長后，用無菌鑷取出施重砝碼、施重玻片和瓊脂凝膠墊，于倒置顯微鏡下觀察標記位置細胞形態(tài)，比較刺激前后同一位置細胞形態(tài)的變化情況。2.1.2.3 總 RNA 提取細胞觀察結(jié)束后，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS 緩沖液沖洗死細胞 2 次，加入 500μl/孔 Trizol 裂解細胞，回收至 1.5mlEP 管后，搖床上搖動 5min 以充分裂解細胞使核蛋白體完全分解。加入 100μl/管氯仿抽提 RNA，震蕩 15s，靜置 15min
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本文編號：2882533