下咽癌組織和循環(huán)miRNA表達譜及miR-4451、miR-200a-3p在預后和脂代謝調控中作用的研究

發(fā)布時間：2020-11-05 12:01

　　背景下咽癌是一類原發(fā)于下咽部的惡性腫瘤,病理類型以鱗狀細胞癌為主。其發(fā)生與過量酗酒以及吸煙有密切關聯(lián)。下咽癌是頭頸外科手術中處理最為棘手的一種腫瘤。其早期沒有特異性癥狀,一旦發(fā)現(xiàn)多為進展期腫瘤。下咽癌易影響上消化呼吸道的生理功能,組織學上缺乏天然的生物學屏障,淋巴引流豐富,容易發(fā)生重復癌,這導致下咽癌治療難度大,容易復發(fā),是頭頸鱗癌中治療難度較大的一種類型。盡管目前對下咽癌的治療已經(jīng)形成了手術加放化療綜合治療的共識,治療手段己經(jīng)有極大豐富,下咽癌的整體治療效果仍然不容樂觀。局部復發(fā)和遠處轉移仍然是下咽治療所面臨的挑戰(zhàn)。腫瘤的個體化治療是當前腫瘤診治的方向。針對患者的自身情況為患者的設計個性化的治療及隨訪方案是腫瘤診治的原則。對腫瘤的復發(fā)及早診斷能夠提高治療的有效性,改善預后。除了傳統(tǒng)的TNM分期系統(tǒng)外,許多分子腫瘤標記物被應用于下咽癌的預后診斷,提高了對下咽癌隨訪的效果并增加了對腫瘤生物學的認識。蛋白與基因等目前作為分子標記物的弊端是其容易受到環(huán)境中理化因素的影響,酶類,濕度及溫度等諸多因素都可能導致降解或變質,干擾表達。對于臨床上常見的儲存標本如血制品和石蠟切片等,這些分子的檢出難度較大。miRNA是一種體內合成的小分子RNA,人體的發(fā)育調節(jié),免疫功,各器官疾病以及腫瘤的發(fā)生,發(fā)展和轉歸均有miRNA的參與。miRNA分布廣泛,在組織、血漿甚至體液中均有表達。其表達相當穩(wěn)定,可以在石蠟組織中長期穩(wěn)定的表達,是一種理想的分子標記物。目前對miRNA在下咽癌預后中的研究缺乏大樣本數(shù)據(jù)的支持,本研究目的在于通過高通量技術篩選并結合生存分析模型,在一個大樣本下咽癌病例中篩選與下咽癌預后相關的miRNA,評估其臨床價值。在體外細胞實驗中驗證其生物功能,并通過預測尋找其靶基因,探索其調控機制,為下咽癌的防控和分子生物研究提供新方向。第一部分下咽癌組織和循環(huán)miRNA表達譜及miR-4451和miR-200a-3p與下咽癌預后相關性的研究目的通過芯片技術和qPCR篩選下咽癌組織和循環(huán)中差異表達的miRNA,結合生存分析篩選與下咽癌預后相關的miRNA,并評估其臨床價值。方法回顧我科2011年1月至2016年1月間的下咽癌患者分為兩組,統(tǒng)計患者的臨床和流行病學資料。對2015年7月至2016年1月之間的患者納入下咽癌表達驗證組,收集采集患者的腫瘤組織,粘膜組織和血漿標本,用于驗證miRNA在腫瘤組織和血漿中的表達。對2011年1月至2015年6月之間的患者納入下咽癌生存分析組,收集患者的的病理切片,并對患者進行生存隨訪,以驗證miRNA與下咽癌預后的相關性。另收集健康對照者血漿標本。提取組織中的miRNA,應用Agilent miRNA芯片(ID:070156)高通量的篩選候選miRNA。本研究采用了兩種篩選策略,(1)以腫瘤和粘膜分組,在下咽癌腫瘤組和粘膜組之間通過芯片篩選差異表達的miRNA;(2)以中位生存期分組,在下咽癌長期生存組和短期生存組的腫瘤組織之間通過芯片篩選差異表達的miRNA。對篩選出的miRNA,在表達驗證組的40對下咽癌腫瘤和粘膜組織中,通過qPCR檢測其表達水平,以檢驗其在下咽癌中差異表達。在血漿中通過qPCR檢測miRNA表達水平,研究其與組織表達水平的相關性,并通過對比正常志愿者的血漿miRNA表達水平,評估及臨床價值。對經(jīng)驗證在下咽癌組織中存在差異表達的miRNA,通過qPCR的方法,在生存分析組患者的腫瘤切片中檢測其表達水平。通過Kaplan-Meier生存分析,采用Log-rank檢驗不同miRNA表達組之間生存時間的差異。結合患者臨床和流行病學資料,通過Cox比例風險模型研究預后相關miRNA的風險比和多因素調整后的風險比,并分析預后相關miRNA與患者臨床和流行病學特征的相關性。通過Harrel's c-index評估包含預后miRNA在內多個協(xié)變量的Cox模型的診斷預測能力,研究miRNA對于預后的臨床價值。并嘗試通過構建miRNA預后指數(shù),充分發(fā)揮miRNA對下咽癌預后診斷的能力。結果在下咽癌腫瘤組和粘膜組之間,芯片篩選出11個差異表達的miRNA,其中腫瘤組中高表達的有l(wèi)et-7c-5p,miR-126-3p,miR-195-5p,miR-29c-3p,miR-451a和miR-497-5p,低表達的有miR-106b-5p,miR-3195,miR-424-5p,miR-4443和miR-93-5p。在下咽癌長期生存組和短期生存組的腫瘤組織之間,芯片篩選14個差異表達的miRNA,其中短期生存組中高表達的有miR-4451,miR-3605-5p,miR-3161,miR-30b-5p,miR-200a-3p,miR-7150,miR-378b和miR-5088-5p,低表達的有miR-200c-3p,miR-429,miR-4688,miR-4701,miR-6808-5p和miR-6813-3p。在40對下咽癌腫瘤和粘膜組織qPCR驗證以上候選miRNA,9個miRNA表達有統(tǒng)計學差異。在下咽癌腫瘤組織中低表達的有miR-126-3p(FC=0.55),miR-195-5p(FC=0.0.71),miR-29c-3p(FC=0.63),miR-451a(FC=0.28)和miR-497-5p(FC=0.49),高表達的有 miR-106b-5p(FC=1.67),miR-93-5p(FC=1.85),miR-4451(FC=1.91)和miR-200a-3p(FC=1.36)。以上差異表達的miRNA中只有miR-93-5p的血漿表達水平于組織表達相關,Spearman相關系數(shù)為0.516,且其表達水平高于健康對照者。ROC檢驗顯示AUG為0.701(p=0.002),在cut-off值0.143處敏感度為0.625,特異度為0.628,約登指數(shù)為0.997。本研究同時證實,RNU48是下咽癌相關實驗合適的內參基因。qPCR檢測上述9個差異表達miRNA在生存分析組372例下咽癌患者腫瘤組織中的含量。Log-rank檢驗顯示miR-4451和miR-200a-3p表達水平與預后相關,miR-200a-3p低表達組預期生存期64.8月(95%CI:59.4-70.1),高表達組預期生存期52.8個月(95%CI:46.8-58.7),miR-4451低表達組的預期生存期65.6個月(95%CI:30.2-71.0),高表達組的生存期52.2個月(95%CI:46.3-58.1)統(tǒng)計學差異均顯著。miR-200a-3p和miR-4451高表達組預后不佳。單因素Cox 比例風險模型顯示結果顯示,miR-200a-3p高表達組相對低表達組的風險比為1.51(95%CI:1.09-2.09),而miR-4451高表達組相對低表達組的風險比為1.64(95%CI:1.18-2.28)。將T分期,N分期,病理分級和原發(fā)部位作為協(xié)變量做多因素Cox分析,以上風險比被調整為1.42(95%CI:1.02-1.98)和1.47(95%CI:1.06-2.06),統(tǒng)計學差異均顯著。T4期患者中miR-200a-3p高表達和miR-4451高表達的比例顯著增加,N2和N3期患者中miR-200a-3p高表達比例增加。以miR-4451和miR-200a-3p表達水平構建預后指數(shù)顯示,兩者共同高表達使患者風險比增加至1.67(單因素,95%CI:1.19-2.33),1.56(多因素,95%CI:1.11-2.20)。Harrel's C-index顯示Cox模型加入miR-4451和miR-200a-3p后診斷預測能力有所增加。結論及意義下咽癌腫瘤組織中,miR-126-3p,miR-195-5p,miR-29c-3p,miR-451 a和miR-497-5p低表達,miR-106b-5p,miR-93-5p,miR-4451和miR-200a-3p高表達。下咽癌患者血漿中miR-93-5p高表達,可作為診斷指標。miR-200a-3p高表達和miR-4451高表達與下咽癌患者預后不佳有關。該研究為下咽癌預后的分子診斷提供了新的方向。第二部分miR-4451靶向ABHD5調控下咽癌FaDu細胞生物學行為和脂代謝的研究目的通過細胞實驗驗證第一部分篩選出的miR-4451和miR-200a-3p對下咽癌FaDu細胞系生物學行為的影響,進一步尋找其下游靶基因并予以功能驗證,在分子水平和細胞水平研究miRNA調控靶基因對下咽癌生物學行為的影響,闡明其功能機制。方法以FaDu細胞為研究對象,通過轉染miRNA mimics和inhibitor干擾細胞內miRNA的表達水平。通過CCK8實驗,Transwell遷移和侵襲實驗,觀察不同miRNA表達水平對下咽癌FaDu細胞增殖、遷移和侵襲的影響。結合TargetScan數(shù)據(jù)庫,miRWalk數(shù)據(jù)庫和mRNA芯片,篩選潛在的miRNA靶基因,并通過Starbase進一步縮小靶基因預測范圍。通過轉染miRNA mimics干擾miRNA細胞內表達水平,結合qPCR和Western blot方法從mRNA和蛋白水平檢測候選靶基因的表達的改變,進一步篩選靶基因。構建pmirGLO靶基因3'UTR質粒,與mimics共轉染Fadu細胞,以雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因。對于篩選的靶基因,在表達驗證組40對下咽癌腫瘤和粘膜組織中通過qPCR檢測其miRNA水平,研究靶基因與下咽癌表達的相關性。在生存分析組的患者中取其中57例患者腫瘤切片行免疫組化染色,半定量檢測其蛋白表達水平,結合患者生存數(shù)據(jù)研究其與下咽癌預后的相關性。對下咽癌FaDu細胞轉染靶基因siRNA干擾其表達,通過CCK8實驗,Transwell遷移和侵襲實驗,觀干擾察靶基因對下咽癌FaDu細胞增殖、遷移和侵襲的影響。對miRNA的功能做回復實驗,共轉染miRNA inhibitor和靶基因siRNA研究其交互作用對FaDu細胞遷移和脂代謝的影響。結果功能實驗表明miR-4451促進下咽癌FaDu細胞的增殖、遷移和侵襲,而miR-200a-3p對下咽癌FaDu細胞增殖無作用。通過生信數(shù)據(jù)庫和miRNA芯片,共篩選ABHD5,SLC37A2和ZNF527為候選靶基因。轉染miR-4451 mimics后ABHD5在mRNA和蛋白水平均有低表達。雙熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)共轉染pmirGLO-ABHDwild type和miR-4451mimics,FL/RL顯著下降,證實ABHD5為miR-4451 的靶基因。qPCR檢測表達驗證組40對組織顯示,腫瘤組織中ABHD5的mRNA表達水平降低。免疫組化染色結果結合生存分析顯示在2012年至2013年的57例下咽癌患者中,低表達ABHD5預后差,預期生存期低表達組vs高表達組為41.7月vs 64.8月。轉染AHBD5 siRNA可促進促進下咽癌FaDu細胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA功能回復實驗表明,轉染ABHD5 siRNA可回復miR-445 1inhibitor對細胞增殖和脂代謝的影響。miR-4451靶向ABHD5促進FaDu細胞遷移作用,同時伴有腫瘤細胞脂滴含量增加。結論及意義miR-4451促進下咽癌FaDu細胞的增殖,遷移和侵襲。miR-4451通過靶向調控ABHD5影響FaDu細胞脂代謝和生物學行為。ABHD5在下咽癌組織中低表達,與下咽癌預后有關,ABHD5可促進下咽癌FaDu細胞的增殖,遷移和侵襲。該部分研究為深入了解下咽癌生物學行為和脂代謝異常提供了新的方向。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

下咽癌,芯片,粘膜,腫瘤