發(fā)布時間：2020-11-21 18:35

　　 第一部分低濃度化療藥物卡鉑誘導(dǎo)癌干細(xì)胞產(chǎn)生 最新研究表明癌癥干細(xì)胞(cancer stem cell)存在于絕大部分的血液或?qū)嵸|(zhì)腫瘤中。癌癥干細(xì)胞具有自我更新self-renew的能力,且可以分裂分化成為成熟癌細(xì)胞并最終形成腫瘤。這些細(xì)胞對常規(guī)的臨床抗癌治療方法具有抗性。隨著對癌干細(xì)胞在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的基礎(chǔ)性作用的認(rèn)識和發(fā)現(xiàn),癌干細(xì)胞的來源和形成越來越受到人們的關(guān)注。本研究的目的是檢測化療藥物刺激后,癌細(xì)胞是否會獲得類癌癥干細(xì)胞的特性。實驗結(jié)果證實,極低濃度的卡鉑carboplatin可以刺激肝癌細(xì)胞加強自我更新(癌細(xì)胞球形成)和增強細(xì)胞多能性(Sox2和Oct3/4表達(dá))。Sox2和Oct3/4表達(dá)被干擾后可以阻斷這種誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步Hoechst33342染色和流式細(xì)胞分選獲得非癌癥干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),用卡鉑類似處理后的非癌干細(xì)胞也能被誘導(dǎo)產(chǎn)生干細(xì)胞特性。這一的數(shù)據(jù)顯示在癌癥發(fā)生發(fā)展中,高度分化的普通癌細(xì)胞也可能是癌干細(xì)胞的一個重要來源。擴展試驗檢測了多能性基因Sox2與Oct3/4被干擾后,癌細(xì)胞對化療藥物的抗性。結(jié)果表明干擾多能性基因的表達(dá)能提高癌細(xì)胞的敏感性,降低其對藥物的耐受。因此多能性基因未來也許可以作為輔助的癌癥治療靶標(biāo),幫助殺滅癌干細(xì)胞,從而長期和根本上提高癌癥的治愈率。 第二部分癌干細(xì)胞研究小鼠模型的鑒定 隨著癌干細(xì)胞研究的深入,其在癌癥病理發(fā)生及治療過程中的作用越來越受到人們的重視。癌干細(xì)胞理論的提出和完善給癌癥的徹底治愈帶來無限希望。目前研究工作主要基于原代癌細(xì)胞,癌細(xì)胞系,或免疫缺陷裸鼠異皮質(zhì)移植動物模型。尚無專用于癌干細(xì)胞研究的小鼠模型。APCmin/+小鼠模型具有自發(fā)性癌癥發(fā)生,短生長周期,性狀穩(wěn)定等優(yōu)勢,是一個優(yōu)秀的腸癌,結(jié)腸癌小鼠模型。尤其在WNT信號通路相關(guān)研究中具有不可替代的作用。本研究對不同年齡APCmin/+小鼠整個小腸腸道腫瘤根據(jù)大小分為大,中,小三組,在體式顯微鏡下,使用顯微手術(shù)工具小心分離并收集組織樣本,然后對各個組的組織進(jìn)行活細(xì)胞分離。細(xì)胞經(jīng)過無血清懸浮培養(yǎng)法檢測其中癌癥干細(xì)胞的多寡,結(jié)果顯示,隨著年齡的增長和癌癥的惡化,癌干細(xì)胞的數(shù)量和比例呈上升趨勢。其次對各組組織進(jìn)行全蛋白抽提,Western Blotting檢測其中干細(xì)胞基因Sox2,Oct4及β-catenin的表達(dá)水平變化,經(jīng)過與內(nèi)部參照基因GAPDH水平比較后發(fā)現(xiàn),這些基因均存在不同程度的激活表達(dá)。趨勢與干細(xì)胞數(shù)量增長一致,從分子水平上反應(yīng)出癌癥的惡化和癌干細(xì)胞的激活。最后,收集全小腸標(biāo)本,制備整腸Swiss卷石蠟切片。用這些基因的抗體通過免疫組織化學(xué)染色的方法,檢測Sox2,Oct4, c-Myc及β-catenin表達(dá)的部位,程度,分布情況。實驗結(jié)果再一次確認(rèn)了這些干細(xì)胞多能性基因的表達(dá)上調(diào)。其中Oct4增強程度強于Sox2.綜上所述APCmin/+小鼠中伴隨著癌癥的白發(fā)發(fā)生和發(fā)展,癌癥干細(xì)胞逐漸增多,多能性基因逐漸激活。說明癌干細(xì)胞在癌癥發(fā)生發(fā)展中起著推動作用。同時APCmin/+小鼠模型不僅可以作為直腸癌模型,而且可以作為癌干細(xì)胞研究的動物模型,對CSC研究產(chǎn)生促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R96;R-332
【部分圖文】：

圖1-2 ABC基因家族蛋白跨物質(zhì)轉(zhuǎn)運模型A跨膜向細(xì)胞轉(zhuǎn)運模型；B跨膜物質(zhì)外排轉(zhuǎn)運模型(摘自 Dong，J. ； G. Yang; H. S. Mchaourab. 2005. Science 308，1023-1028.)家族，特別是人 ABCBl (MDRl，P-gp) ABCG2 (or BCRP，MXR)和鼠 Mdrla/lb, Bcrpl^]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白在各組織中廣泛分布，例如ABCBl存在于肝臟，腎臟，小腸，內(nèi)皮細(xì)胞，胰臟，胎盤和外周血細(xì)胞中而ABCG2存在于胎盤，腦，腎臟，肝臟，睪丸，卵巢_。雖然這些轉(zhuǎn)運蛋白的生理功能還沒有研究透徹，部分功能已經(jīng)得到實驗的證實。首先主動排出外來可穿透細(xì)胞膜的分子的能力可以作為細(xì)胞的一種自我保護機制。在正

無血清懸浮培養(yǎng)癌細(xì)胞球富集癌干細(xì)胞A癌細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)條件下成球；B成球細(xì)胞具有癌干細(xì)胞特性，并表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志分子。（摘自 The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism January 1，2010 vol. 95 no. 1. 439-444 )可以誘導(dǎo)肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞顯著地加強自我更新（在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液中形成癌細(xì)胞球）和增強多能性（Sox2和0ct3/4 RNA水平和蛋白表達(dá)水平的增高，二者被認(rèn)為是誘導(dǎo)和維持多能性的關(guān)鍵性因子），并且使用aiRNA干擾Sox2和Oct3/4后可以阻斷這種誘導(dǎo)作用。出乎意料的是，進(jìn)一步Hoechst 33342染色和流式細(xì)胞分選獲得的非癌癥干細(xì)胞，經(jīng)卡鈾的類似處理也能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生干細(xì)胞特性。綜上發(fā)現(xiàn)，13

HepG2的毒害作用。用MTT的方法測試了不同濃度（0?300tiM)卡鈾處理對細(xì)胞生長的抑制作用。如圖2-1，48小時處理后，卡鈾在兩細(xì)胞系中的50%生長抑制濃度Huh7為176. 7 u M，在HepG2細(xì)胞中為194 u M, HepG233
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本文編號：2893426