發(fā)布時(shí)間：2021-03-26 09:55

  背景和目的: 1型糖尿病被認(rèn)為是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的選擇性破壞胰島β細(xì)胞的一種自身免疫性疾病。T1DM患者一旦出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,約有80%的胰島已經(jīng)被破壞,因此強(qiáng)調(diào)T1DM的早期診斷和早期預(yù)防的意義顯得尤為重要。一系列的自身抗原包括胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島素瘤相關(guān)蛋白2(IA-2)、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8(ZnT8)等被認(rèn)為是啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)的靶抗原。同時(shí),一些細(xì)胞因子、趨化因子及炎癥介質(zhì)也參與了該自身免疫過(guò)程。其中,可產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子的Th1型細(xì)胞是致病性T細(xì)胞,而Th2型T細(xì)胞通過(guò)釋放IL-4和IL-10介導(dǎo)糖尿病的免疫保護(hù)作用。在應(yīng)用NOD鼠的研究中證實(shí),胰島素/前胰島素尤其是胰島素B9~23肽段是啟動(dòng)NOD鼠自身免疫性糖尿病的最主要的自身抗原[1]。借助于NOD鼠模型,應(yīng)用胰島素或胰島素多肽進(jìn)行了大量的抗原特異性免疫治療的研究,如鼻內(nèi)或皮下給予胰島素B9-23多肽或改變的胰島素B9-23多肽可以延緩自身免疫性糖尿病的發(fā)展[2-3].但這個(gè)過(guò)程一般都需要借助于免疫佐劑的作用來(lái)刺激并增強(qiáng)抗原的免疫原性,單獨(dú)應(yīng)用抗原本身可能不足以被抗原遞呈細(xì)胞所遞呈,誘導(dǎo)免疫耐受。本研究著眼于抗原與抗原遞呈細(xì)胞之間的相互作用,應(yīng)用胰島素B9-23多肽體外負(fù)載DCs,探討其在誘導(dǎo)自身免疫耐受中的作用及相關(guān)機(jī)制。 樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells , DCs)是體內(nèi)最重要的專(zhuān)職性抗原遞呈細(xì)胞,在自身免疫性糖尿病的發(fā)病過(guò)程中具有重要的作用,同時(shí),DCs在維持機(jī)體的中樞免疫耐受和外周免疫耐受中也發(fā)揮著極其重要的作用[4],因而對(duì)自身免疫性疾病的治療也具有重要的意義。在穩(wěn)定狀態(tài)下,DCs表達(dá)低水平的共刺激分子,具有較強(qiáng)的攝取抗原的能力,但刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力較弱,從而誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受。DCs提供T淋巴細(xì)胞活化所必需的3個(gè)信號(hào)[5]。第一信號(hào)為DCs提呈的抗原肽-MHC分子復(fù)合物與T細(xì)胞受體(TCR)的結(jié)合;第二信號(hào)為DCs表面的協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合;第三信號(hào)為DCs分泌的細(xì)胞因子促使活化的抗原特異性T淋巴細(xì)胞分化為不同的效應(yīng)性T細(xì)胞亞群。只有當(dāng)這些信號(hào)同時(shí)具備時(shí),初始T淋巴細(xì)胞才能被有效地激活成為效應(yīng)性T細(xì)胞,發(fā)揮免疫效應(yīng)功能,如果缺乏有效的第二信號(hào),抗原特異性T淋巴細(xì)胞將發(fā)生調(diào)亡或被誘導(dǎo)成無(wú)能狀態(tài),形成免疫耐受。DCs表面表達(dá)的CD40、CD80、CD86是與T淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)受體CD40L以及CD28分子結(jié)合的最主要的協(xié)同刺激分子,本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)有效沉默共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達(dá),使其處于發(fā)育的不成熟階段,然后體外負(fù)載胰島素B9-23多肽,制備出致耐受性DCs疫苗,觀察其對(duì)同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的作用,進(jìn)而探討其在自身免疫性糖尿病的預(yù)防和治療中的作用,為自身免疫性糖尿病的防治提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: ①siRNA合成 設(shè)計(jì)并合成針對(duì)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的特異性siRNA,綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA是由非靶向任何已知的細(xì)胞mRNA的20-25個(gè)亂序核苷酸組成。 ②細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌取ICR小鼠的骨髓細(xì)胞,用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng),同時(shí)加入10ng/ml的GM-CSF以及10ng/ml的IL-4誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的產(chǎn)生,第2天及第4天進(jìn)行半量換液。第6天,收集細(xì)胞,按2×105/孔加入24孔板中,370C5%CO2培養(yǎng)24小時(shí),將其分為siRNA轉(zhuǎn)染組(A)、陰性對(duì)照組(B)、空白對(duì)照組(C)FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照組(D)。 ③轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine2000包裹siRNA并轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞,抑制共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達(dá)。 ④轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的形態(tài)以及初步判斷轉(zhuǎn)染效率。 ⑤流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率以及各組骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞的表面CD11c,CD80,CD86,CD40,MHC-Ⅱ的表達(dá)。 ⑥r(nóng)t-PCR 檢測(cè)基因水平上CD80、CD86、CD40的表達(dá)情況,觀察CD80/86/40特異的siRNA引起的靶細(xì)胞內(nèi)目的基因的沉默效果。 ⑦混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 無(wú)菌分離ICR小鼠的脾淋巴細(xì)胞,于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3個(gè)小時(shí),收集懸浮細(xì)胞作為T(mén)淋巴細(xì)胞,按1:5的比例將T淋巴細(xì)胞和25ug/ml的絲裂霉素C滅活的樹(shù)突狀細(xì)胞混合培養(yǎng),同時(shí)加入20ug/ml的胰島素B9-23多肽,370C 5%CO2培養(yǎng)72小時(shí),在培養(yǎng)結(jié)束前的18小時(shí),加入3H-Tdr,送同位素科檢測(cè)CPM值。 ⑧細(xì)胞因子檢測(cè) 收集各組混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10和IFN-γ的水平。 結(jié)果: ①共聚焦顯微鏡下觀察約80%的細(xì)胞內(nèi)具有綠色熒光。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為79.92%,各組BMDC的CD11c的表達(dá)均在60%以上,與B、C兩組相比,A組CD80、CD86、CD40的表達(dá)降低,但是并沒(méi)有顯著差異。 ③rt-PCR的結(jié)果顯示,A組的CD80、CD86、CD40的表達(dá)下調(diào)。 ④混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):A組、B組、C組的CPM值分別為2424.67±169.36、7484.33±133.44、7735.33±539.87,A組樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著低于B組和C組,p0.01。 ⑤細(xì)胞因子的檢測(cè):A組、B組、C組樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分泌的IL-10(pg/ml)的水平分別為522.72±6.92、483.40±4.70、483.91±6.82,分泌的IFN-γ(pg/ml)的水平分別為1654.95±39.79、1971.76±62.85、1936.87±61.96,A組與B、C兩組相比,T淋巴細(xì)胞分泌較多的IL-10以及較少的IFN-γ,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。 結(jié)論: 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)能夠有效抑制小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達(dá),制備出耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞。經(jīng)胰島素B9-23多肽負(fù)載后,具有較弱的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力,并且誘導(dǎo)初始T淋巴細(xì)胞向Th2方向分化,分泌較多的IL-10,而IFN-γ的分泌顯著減少。這些研究表明,胰島素B9-23多肽體外負(fù)載耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能、使其向Th2方向分化而發(fā)揮致免疫耐受作用,對(duì)自身免疫性糖尿病的早期防治具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張臨友,高源;設(shè)計(jì)樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗誘發(fā)外周免疫耐受治療自身免疫疾病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2004年02期

2 ;Immune tolerance induced by adoptive transfer of dendritic cells in an insulin-dependent diabetes mellitus murine model[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年01期

3 付必莽;何曉順;余思;胡安斌;馬毅;黃潔夫;;小鼠骨髓源半成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與初步鑒定[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2008年04期

本文編號(hào)：2020359