發(fā)布時間：2020-11-20 00:53

　　 內(nèi)向整流性鉀離子通道（Kir）是一類在多種組織中廣泛分布的鉀離子通道，自1993年克隆了第一個Kir通道至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有約20個成員，構(gòu)成了一個由七個亞家族（Kir1.x-Kir7.x）組成的超家族。Kir 通道的共同特點是它們的內(nèi)向整流特性，即鉀離子內(nèi)流較外流容易得多。這一特點使其在維持細(xì)胞正常興奮性、保持血鉀平衡等方面起發(fā)揮重要的生理作用。同時各亞家族Kir通道在功能上也有各自的特點，如：Kir1.x主要表達(dá)于腎臟上皮細(xì)胞，它們對細(xì)胞內(nèi)pH在生理范圍的變化非常敏感，酸性條件可使該通道關(guān)閉，而堿性條件使其開放，在腎小管上皮細(xì)胞H+和K+的分泌過程中起重要作用；Kir2.x主要表達(dá)于心臟、骨骼肌和神經(jīng)系統(tǒng)，其電流表現(xiàn)很強的內(nèi)向整流特性，它在維持心臟及腦組織的興奮性方面有重要的意義；Kir3.x表達(dá)于心血管和神經(jīng)組織中，它的特點是功能受G蛋白的調(diào)節(jié)，某些G蛋白偶聯(lián)受體可通過影響Kir3.x的功能影響心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的興奮性； Kir6.x和SUR（磺酰脲受體）亞單位共同構(gòu)成ATP敏感的Kir通道（KATP），細(xì)胞內(nèi)核苷酸可以調(diào)節(jié)其功能，它參與調(diào)節(jié)胰島素的分泌和心肌及腦組織在缺血狀態(tài)下的保護(hù)性反應(yīng)；Kir4.x、Kir5.x和Kir7.x的功能尚不十分清楚。近來的研究發(fā)現(xiàn)所有Kir通道有一共同特點即它們的功能均依賴于一種膜磷脂——磷酸肌醇（4，5）二磷酸（PIP2），另外Kir通道的功能還可受細(xì)胞內(nèi)外其它多種因素的調(diào)節(jié)，而各種Kir通道受這些因素調(diào)節(jié)的情況并不相同。本實驗以非洲爪蟾卵母細(xì)胞和培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞株為表達(dá)系統(tǒng)，在細(xì)胞中表達(dá)了不同Kir通道及與Kir調(diào)節(jié)有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，對Kir通道受多種因素的調(diào)節(jié)情況以及PIP2在這些調(diào)節(jié)中所起的作用進(jìn)行了研究。 一、在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)向整流性鉀離子通道及內(nèi)向整流性鉀離子通道的電流特性 目的：在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)向整流性鉀離子通道。研究內(nèi)向整流性鉀離子通道的電生理學(xué)特性。 方法：(1) cRNA的體外轉(zhuǎn)錄：所有的Kir通道均克隆到質(zhì)粒載體 WP=5 pGEMHE中，其序列經(jīng)測序驗證。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶將質(zhì)粒線性化后，用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit 體外轉(zhuǎn)錄得來各種Kir通道的cRNA。(2)爪蟾卵母細(xì)胞的分離：在爪蟾冰凍麻醉狀態(tài)下，下腹部剪開一約0.5 cm的小口，取出卵母細(xì)胞。在含2mg/ml膠原酶的OR2液中振蕩消化1.5-2小時，OR2液的成分為（mM）NaCl 82.5， KCl 2，MgCl2 1，HEPES 5（pH=7.4）。待細(xì)胞消化為單細(xì)胞后用ND96液清洗細(xì)胞。（3）爪蟾卵母細(xì)胞的RNA注射：將各種離子通道cRNA根據(jù)其表達(dá)情況按每個卵母細(xì)胞0.5-10 ng/50 nl注射，注射后的細(xì)胞在含2.5 mM丙酮酸鈉的ND96中19-20℃培養(yǎng), ND96溶液構(gòu)成為 (mM): NaCl 96，KCl 1, CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 5, pH 7.4。（4）用雙電極電壓鉗（two-microelectrode voltage clamp，TEVC）方法檢測各種Kir通道在卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況和電流特性。 結(jié)果：（1）質(zhì)粒DNA的酶切線性化電泳分析：用合適的限制性核酸內(nèi)切酶在插入片斷的下游將環(huán)狀的質(zhì)粒DNA線性化，用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分析線性化結(jié)果。環(huán)狀質(zhì)粒電泳顯示兩條或兩條以上的泳帶；而線性化完全的質(zhì)粒DNA電泳顯示一條泳帶，通過該泳帶的電泳位置與DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker對照可粗略得出該質(zhì)粒DNA的分子量。（2）體外轉(zhuǎn)錄RNA的電泳分析：由于RNA本身有比較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，所以用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳所得到的一般為多條模糊的泳帶。我們用甲醛和去離子甲酰胺共同作用使RNA變性以破壞其二級結(jié)構(gòu)，此時再用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳方法可得到一條清晰的RNA條帶，其分子量可與RNA分子量Marker 對照得出。（3）電生理實驗結(jié)果：向卵母細(xì)胞注射RNA后的第2~3天，即可用TEVC方法檢測到Kir電流。以Kir2.1為例，鉗制電壓為-100mV (或-120mV) 逐漸變至+80mV，當(dāng)灌流液為高鉀的ND96K液時，從所表達(dá)Kir電流的電壓電流曲線可以看出Kir通道的內(nèi)向電流較大且隨著電壓增加而增大，而外向電流很小且沒有明顯的電壓依賴性。Kir通道的內(nèi)向與外向電流轉(zhuǎn)換時的電流為零，此時的電位為反轉(zhuǎn)電位，反轉(zhuǎn)電位為的位置與細(xì)胞外的鉀離子濃度有關(guān)。在高鉀ND96K溶液灌流的情況下，其反轉(zhuǎn)電位接近0 mV；在低鉀ND96溶液灌流的情況下，反轉(zhuǎn)電位接近-90mV，與兩種鉀離子濃度下用Nerst方程所計算的鉀平衡電位一致。用鉀通道的阻斷劑BaCl2可以阻斷所表達(dá)的Kir電流。同樣，在爪蟾卵母細(xì) WP=6 胞中表達(dá)其它種類的Kir通道也具有以上同樣的電生理特性（結(jié)果未顯示）。 結(jié)論：以爪蟾卵母細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)，將體外轉(zhuǎn)錄得來的RNA以微注射方式注入卵母細(xì)胞可表達(dá)Kir通道。用雙電極電壓鉗方法可觀察卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Kir通道的電生理特性：（1）Kir 通道電流的內(nèi)向整流性，即鉀離子由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)流較由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外流容易。（2）Kir通道電流的反轉(zhuǎn)電位與細(xì)胞外鉀離子濃度有關(guān)，即與鉀離子的平衡電位有關(guān)。（3）Ba2+可通過與Kir通道的孔區(qū)結(jié)合而阻斷Kir通道的鉀電流。 二、細(xì)胞內(nèi)pH降低對內(nèi)向整流性鉀離子通道功能的調(diào)節(jié) 目的：以代謝抑制劑AzideNa(疊氮鈉)及KHCO3(碳酸氫鉀)降低細(xì)胞內(nèi)的pH，研究細(xì)胞內(nèi)pH降低對Kir2.1、Kir2.3和Kir3
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R33
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
研究論文 內(nèi)向整流性鉀離子通道功能調(diào)節(jié)的研究
    引言
    第一部分 在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)向整流性鉀離子通道
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        附圖
        討論
        小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第二部分 細(xì)胞內(nèi)pH對內(nèi)向整流性鉀離子通道功能的調(diào)節(jié)
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        附圖
        討論
        小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第三部分 Characteristic interactions with PIP2 determine regulation of Kir channels by diverse modulators
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        附圖
        討論
        小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    第四部分 PIP2水解在PKC抑制內(nèi)向整流性鉀離子通道中的作用
        前言
        材料與方法
        結(jié)果
        附圖
        討論
        小結(jié)
        參考文獻(xiàn)
    結(jié)論
綜述
致謝
個人簡歷

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔣學(xué)俊,李曉艷,Randall L Rasmusson;離子通道在卵母細(xì)胞中的表達(dá)及電生理實驗方法[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2000年01期

2 蔣學(xué)俊,李曉艷,Randall L.Rasmusson;離子通道在卵母細(xì)胞中的表達(dá)及電生理實驗方法[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2000年04期

本文編號：2890687