發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 12:37

　　 研究背景與研究目的卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一,最常見(jiàn)的是缺血性卒中。目前認(rèn)為唯一有效的治療措施是時(shí)間窗內(nèi)恢復(fù)血流,包括重組組織纖維蛋白溶酶源激活劑(recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)靜脈溶栓和機(jī)械取栓治療。但是狹窄的治療時(shí)間窗(4.5h內(nèi))和相對(duì)較高的顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)限制了r tPA的臨床應(yīng)用。尤其是腦血流恢復(fù)后還可能進(jìn)一步觸發(fā)腦缺血/再灌注(ischemia/reperflusion,I/R)損傷,因此神經(jīng)保護(hù)劑仍然被認(rèn)為是治療缺血性卒中的更有效的方法。缺血性損傷,尤其是腦血流恢復(fù)后觸發(fā)的腦I/R損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜,包括能量代謝損害、谷氨酸或神經(jīng)毒素釋放、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和自噬。因此針對(duì)單一靶點(diǎn)的藥物或單純應(yīng)用一種神經(jīng)保護(hù)劑不足以改善缺血性卒中的臨床預(yù)后。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明:炎癥反應(yīng)和自噬主要引起了腦I/R損傷的級(jí)聯(lián)性損害。腦I/R損傷的動(dòng)物模型已經(jīng)證實(shí)調(diào)整腦內(nèi)自噬過(guò)程可以改善其神經(jīng)功能損害。除此之外研究證實(shí)腦脊液中自噬水平與缺血性卒中的預(yù)后相關(guān)。因此以上證據(jù)提示我們靶向作用于炎癥和自噬過(guò)程的藥物可能是有效治療腦I/R損傷的有效措施。2013年美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(American Heart Association,AHA)和美國(guó)卒中學(xué)會(huì)(American Stroke Association,ASA)聯(lián)合頒布的急性缺血性卒中早期管理指南中,首次推薦他汀類藥物做為神經(jīng)保護(hù)劑。他汀類藥物在腦I/R損傷的動(dòng)物模型中通過(guò)減輕炎癥損傷、調(diào)節(jié)血栓形成、改善內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管生成、減少氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,這一點(diǎn)毫無(wú)爭(zhēng)議。但是臨床使用他汀類藥物對(duì)缺血性卒中患者的預(yù)后改善仍然存在爭(zhēng)論,究其原因可能是由于他汀使用的劑量和依從性導(dǎo)致,還可能是由于腦I/R損傷的復(fù)雜的病理生理機(jī)制引起的。另外,他汀類藥物在其他疾病中已被證實(shí)可以通過(guò)調(diào)節(jié)自噬來(lái)改善疾病的預(yù)后,比如帕金森病、缺血性和非缺血性心肌病變、脊髓損傷以及哮喘;然而,迄今為止,沒(méi)有任何證據(jù)可以證明他汀是否可以通過(guò)調(diào)整自噬過(guò)程來(lái)發(fā)揮對(duì)抗腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。因此以上這些提示我們作用于自噬過(guò)程的藥物可能會(huì)有效提高他汀對(duì)抗腦缺I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator,SIR)基因(sirtuins)是一組從古細(xì)菌到高等真核生物均高度保守的煙酰胺腺苷酸核酸(nieotimide adenosine dinueleotide,NAD)依賴的去乙�；�酶。廣泛存在于原核生物和真核生物中。在轉(zhuǎn)錄沉寂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色質(zhì)穩(wěn)定、雙鏈DNA斷裂損傷后生理修復(fù)等方面起重要作用,參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞壽命的調(diào)節(jié)。在所有的sirtuins中,SIRT1受到了最多的關(guān)注,它能夠調(diào)節(jié)許多重要的信號(hào)通路,包括DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡,肌肉和脂肪分化,神經(jīng)發(fā)生,線粒體生物發(fā)生,葡萄糖和胰島素穩(wěn)態(tài),激素分泌,細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和晝夜節(jié)律。合成或者天然的SIRT1激活劑(sirtuin activating compounds,STACs)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、減緩炎癥的發(fā)展、防治心血管疾病以及Ⅱ型糖尿病。在迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有天然SIRT1激活劑中,白藜蘆醇(Resveratrol,RES)(3,5,4'-三羥基-二苯乙烯)是最有效的。RES被證實(shí)具有保護(hù)大鼠免受腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用,其神經(jīng)保護(hù)作用涉及到以下幾種機(jī)制:抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)和抗凋亡。更重要的是,RES被認(rèn)為是天然的自噬調(diào)節(jié)劑。研究證實(shí)RES可以通過(guò)上調(diào)自噬水平緩解大鼠的腦I/R損傷。我們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物和RES在對(duì)抗腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用方面具有一些共同的通路。其中瑞舒伐他汀(Rosuvastatin,ROS)由于其低細(xì)胞毒性和多效性優(yōu)于其他類型的他汀類藥物,被廣泛推薦用于缺血性卒中的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防治療。因此我們推測(cè)RES和ROS聯(lián)合治療可能具有協(xié)同對(duì)抗腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。在本研究中,我們使用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)90分鐘后再灌注24小時(shí)作為腦I/R損傷的動(dòng)物模型。我們?cè)噲D證實(shí)RES和ROS聯(lián)合預(yù)處理對(duì)大鼠腦I/R損傷具有協(xié)同的神經(jīng)保護(hù)作用,并探討其可能的機(jī)制。研究方法1.SPF級(jí)健康成年雄性Sprague Dawley大鼠60只,體重200-220g,接受暫時(shí)性MCAO手術(shù)作為腦I/R損傷的動(dòng)物模型。大鼠被隨機(jī)分為4組(每組n = 15):MCAO模型對(duì)照組,單獨(dú)RES預(yù)處理組,單獨(dú)ROS預(yù)處理組,以及RES和ROS聯(lián)合預(yù)處理組。RES(50mg/kg)通過(guò)腹腔注射給藥,ROS(10mg/kg)通過(guò)灌胃給藥,對(duì)照組大鼠則給予等量的生理鹽水灌胃和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)腹腔注射。所有的藥物治療均為每天一次,在腦缺血發(fā)生前連續(xù)給藥7天。2.再灌注24小時(shí)后,通過(guò)盲法檢查者使用修正的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重程度評(píng)分(modified neurological severity scores,mNSS)進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)估,并通過(guò)3,5-三苯基四氮挫氯化物(3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色法測(cè)定局部梗死體積。3.再灌注24小時(shí)后,用Western Blot法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白(Bax,Bcl-2,caspase-3),促炎細(xì)胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)以及自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ,LC3Ⅰ和Becline-1)的表達(dá)水平。結(jié)果1.ROS聯(lián)合RES預(yù)處理對(duì)腦I/R損傷具有協(xié)同保護(hù)作用與對(duì)照組相比,單獨(dú)RES預(yù)處理、單獨(dú)ROS預(yù)處理以及ROS聯(lián)合RES預(yù)處理均能明顯降低腦I/R損傷引起的腦梗死體積和神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。更重要的是:ROS聯(lián)合RES預(yù)處理組大鼠的腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分比單獨(dú)RES預(yù)處理組或單獨(dú)ROS預(yù)處理組更低。而單獨(dú)RES預(yù)處理組和單獨(dú)ROS預(yù)處理組在腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分方面并無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果提示缺血前ROS聯(lián)合RES預(yù)處理具有協(xié)同保護(hù)腦I/R損傷的能力。2.ROS聯(lián)合RES預(yù)處理在大鼠局灶性腦I/R損傷中具有協(xié)同抗凋亡作用我們發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,單獨(dú)RES預(yù)處理、單獨(dú)ROS預(yù)處理以及ROS聯(lián)合RES預(yù)處理均能顯著增加缺血側(cè)腦組織內(nèi)Bcl-2的表達(dá),并顯著降低Bax和caspase-3表達(dá)。更重要的是,與單獨(dú)RES預(yù)處理或單獨(dú)ROS預(yù)處理相比較,ROS聯(lián)合RES預(yù)處理能顯著增加缺血側(cè)腦組織內(nèi)Bcl-2表達(dá),并顯著降低Bax和caspase-3表達(dá),而且聯(lián)合預(yù)處理能顯著增加缺血側(cè)腦組織內(nèi)Bcl-2/Bax比率。然而單獨(dú)RES預(yù)處理和單獨(dú)ROS預(yù)處理在缺血側(cè)腦組織內(nèi)Bc1-2,caspase-3和Bax的表達(dá)上無(wú)顯著性差異。因此,這些結(jié)果提示在大鼠局灶性腦I/R損傷中,缺血前ROS聯(lián)合RES預(yù)處理的協(xié)同保護(hù)作用可能與其協(xié)同抗凋亡作用相關(guān)。3.ROS聯(lián)合RES預(yù)處理在大鼠局灶性腦I/R損傷中具有協(xié)同抗炎作用我們western blot方法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織內(nèi)炎癥因子白介素-1β(IL-1β)的含量。結(jié)果提示:與對(duì)照組相比,單獨(dú)RES預(yù)處理、單獨(dú)ROS預(yù)處理以及ROS聯(lián)合RES預(yù)處理均能明顯降低缺血側(cè)腦組織內(nèi)IL-1β含量。我們還發(fā)現(xiàn):與單獨(dú)RES預(yù)處理或單獨(dú)ROS預(yù)處理相比較,ROS聯(lián)合RES預(yù)處理能顯著降低缺血側(cè)腦組織內(nèi)IL-1β含量。然而單獨(dú)RES預(yù)處理和單獨(dú)ROS預(yù)處理在缺血側(cè)腦組織內(nèi)IL-1β的表達(dá)上無(wú)顯著區(qū)別。因此,這些結(jié)果提示在大鼠局灶性腦I/R損傷中,缺血前ROS聯(lián)合RES預(yù)處理的協(xié)同保護(hù)作用可能與其協(xié)同抗炎作用相關(guān)。4.ROS聯(lián)合RES預(yù)處理在大鼠局灶性腦I/R損傷中具有協(xié)同激活自噬的作用與對(duì)照組相比,單獨(dú)RES預(yù)處理、單獨(dú)ROS預(yù)處理以及ROS聯(lián)合RES預(yù)處理能明顯增加缺血側(cè)腦組織內(nèi)Becline-1的表達(dá)和LC3I1/LC3I比率。更重要的是我們還發(fā)現(xiàn):與單獨(dú)RES預(yù)處理或單獨(dú)ROS預(yù)處理相比較,ROS聯(lián)合RES預(yù)處理能顯著增加缺血側(cè)腦組織內(nèi)Becline-1的表達(dá)和LC3II/LC3I比率。然而單獨(dú)RES預(yù)處理和單獨(dú)ROS預(yù)處理組在缺血側(cè)腦組織內(nèi)Becline-1的表達(dá)和LC3II/LC3I比率上無(wú)明顯區(qū)別。因此,這些結(jié)果提示在大鼠局灶性腦I/R損傷中,缺血前ROS聯(lián)合RES預(yù)處理的協(xié)同保護(hù)作用可能與其協(xié)同激活自噬相關(guān)。結(jié)論及意義:1.ROS可能通過(guò)增強(qiáng)自噬激活作為改善局灶性腦I/R損傷預(yù)后的潛在機(jī)制;2.ROS和RES聯(lián)合治療對(duì)于腦I/R損傷具有協(xié)同的神經(jīng)保護(hù)作用,可能通過(guò)抗凋亡、抗炎以及激活自噬等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

圖２：凋亡細(xì)胞死亡途徑??巨自噬（圖３）?［３８］。微自噬是指通過(guò)溶酶體膜內(nèi)陷、突出和分離過(guò)程直接吞噬細(xì)??胞質(zhì)成分，有降解長(zhǎng)壽命蛋白和膜蛋白、通過(guò)消耗多余的膜來(lái)維持和調(diào)節(jié)膜穩(wěn)態(tài)??和溶酶體大小的作用［３９］。伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬通過(guò)溶酶體伴侶蛋白熱休克組成型??蛋白?７０?（Ｈｓｃ７０）和溶酶體相關(guān)膜蛋白－２Ａ?（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｍｅｍｂｒａｎｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２，ＬＡＭＰ－２Ａ），一種溶酶體膜受體來(lái)運(yùn)輸未折疊的蛋白質(zhì)。巨自噬通過(guò)自噬體發(fā)??生，雙膜結(jié)合的囊泡與溶酶體融合，隨后降解蛋白質(zhì)［４Ｍ１］，其中巨自噬（以下簡(jiǎn)??稱自嗤）是自唾最主要和最好的研究形式。??越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬廣泛參與缺血性卒中引起的腦損傷。然而，關(guān)于自??噬在缺血性中風(fēng)中的確切作用，似乎尚未達(dá)成共識(shí)。大量的體內(nèi)和體外的研究表??明自噬在缺血性中風(fēng)中有保護(hù)作用［４２，４３，４４］，亦有大量的研究表明了自噬在缺血性??中風(fēng)中的不利影響［４ＭＭ７］。有學(xué)者分析關(guān)于自噬在腦缺血中的作用的以往研究，??［４８］??

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???作用；２、抑制自噬可以減輕腦損傷：Ｗａｎｇ＃［５１］發(fā)現(xiàn)３－ＭＡ處理后可減輕Ｉ／Ｒ期間??的自噬并減少線粒體功能的下降。２以％等［５２］發(fā)現(xiàn)腹腔注射褪黑素能通過(guò)對(duì)??ＭａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙＭｉｃｒｏａｕｔｏｈａ

用眼科剪在ＣＣＡ上剪一小的切口，根據(jù)大鼠的體重選擇合適的線栓，將線栓從切??口處插入，取下動(dòng)脈夾，將線栓向ＩＣＡ方向插入，直到插入１６－２０毫米，感到阻??力時(shí)，將線栓用結(jié)扎線固定在ＣＣＡ上，并開始記時(shí)（圖４，?Ａ）。逐層縫合、并用??酒精棉球消毒皮膚縫合處。待大腦中動(dòng)脈（ｍｉｄｄｌｅ?ｃｅｒｅｂｒａｌ?ａｒｔｅｒｙ，?ＭＣＡＯ）閉塞??９０ｍｉｎ后小心拔出線栓進(jìn)行再灌注。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，大鼠肛溫維持在３７±０．５°Ｃ。??２．３神經(jīng)功能缺損評(píng)分：??大鼠再灌注２４小時(shí)后，根據(jù)大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ??ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｅｖｅｒｉｔｙ?ｓｃｏｒｅ，?ｍＮＳＳ），由盲檢者對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損的評(píng)估。??評(píng)分在０－］８分之間，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴(yán)重。造模成功的大鼠可出??現(xiàn)行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，右眼可出現(xiàn)Ｈｏｎｅｒ征（圖４，?Ｂ＆Ｃ）。有文獻(xiàn)報(bào)道，在缺血６??小時(shí)后，較低的ｍＮＳＳ評(píng)分（ｍＮＳＳ＜?３．５分）可能提示沒(méi)有梗死灶形成［Ｓ６］。因此??我們剔除了腦Ｉ／Ｒ損傷２４小時(shí)后ｍＮＳＳ＜４分及死亡的大鼠
【參考文獻(xiàn)】

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