發(fā)布時間：2020-06-12 18:11

【摘要】：研究背景與目的:膠質(zhì)母細胞瘤是是膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的腫瘤集合,它是最常見和最致命的原發(fā)性腦腫瘤~([1]),也是最具攻擊性的膠質(zhì)瘤類型。由于其復(fù)雜的表型,它也被稱為多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)。多形性膠質(zhì)母細胞瘤是惡性程度最高的膠質(zhì)瘤(世界衛(wèi)生組織WHO IV級),盡管使用目前的標(biāo)準(zhǔn)治療,進行了積極的手術(shù)、放射治療和化療干預(yù),患者的中位生存期也僅為診斷后15個月~([2])。近年來,白藜蘆醇,一種存在于虎杖、桑椹和葡萄等植物中的多酚類化合物,它具有諸如預(yù)防腫瘤和心腦血管疾病、抗炎和抗氧化等有益的生物學(xué)功效。業(yè)已發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能有效抑制多種腫瘤細胞的體外生長,誘導(dǎo)其分化和凋亡,其中包括膠質(zhì)母細胞瘤細胞系。但是不同的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系由于某些未知原因?qū)ζ渚哂兴幬锩舾行圆町�。外泌體是一類由活細胞主動分泌到體外的,直徑在30nm-200nm的盤狀微囊泡,其中包含了多種復(fù)雜的RNA以及蛋白質(zhì)等。它可介導(dǎo)細胞間的交流和遷移,與腫瘤細胞的生長也有密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞會分泌大量攜帶惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的外泌體,推測其與腫瘤細胞的藥物敏感性密切相關(guān)。鑒于以上相關(guān)資料的搜集與整理,本課題研究,認為外泌體可能是造成膠質(zhì)母細胞瘤白藜蘆醇敏感性差異的可能原因。為此,本實驗?zāi)康臑?1.驗證U251、LN428膠質(zhì)瘤細胞對白藜蘆醇的藥物敏感性差異。2.探究腫瘤外泌體與U251、LN428共培養(yǎng)后,對白藜蘆醇藥物敏感性的改變。3.檢測白藜蘆醇處理前后U251、LN428膠質(zhì)瘤細胞外泌體各蛋白的表達差異,探究導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細胞白藜蘆醇敏感性的差異的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。4.通過蛋白調(diào)控因子的生物信息學(xué)分析探究其藥物敏感調(diào)控功能。材料與方法:本課題選用一對白藜蘆醇敏感和耐藥的人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和LN428細胞作為研究對象,采用MTT法核實白藜蘆醇對兩者的敏感性差異;通過HE染色觀察藥物處理后細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。同時,采用超速離心法提取白藜蘆醇用藥前后U251及LN428細胞上清液中外泌體,通過電鏡及Western-blotting對其加以鑒定。應(yīng)用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)對各組外泌體進行定量分析,測定細胞的外泌體分泌水平。為探究外泌體對細胞藥物敏感性的影響,將LN428細胞與U251/N或U251/Res外泌體共孵育48h后再用濃度為100μmol/L的白藜蘆醇處理48h;反之亦然,將U251細胞與LN428/N或LN428/Res外泌體共孵育48h后再用濃度為100μmol/L的白藜蘆醇處理48h,最后將各組進行MTT檢測其細胞活性。為了進一步探討不同人膠質(zhì)母細胞瘤對白藜蘆醇的敏感性差異,先運用BCA法對外泌體總蛋白進行定量,然后通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對外泌體各蛋白進行定性與定量,分析比對加藥前后各指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致藥物敏感或耐受的因子,通過GO富集分析和KEGG生物信息學(xué)分析對其功能及分子機制進行預(yù)測,并總結(jié)其相互關(guān)聯(lián)及影響。結(jié)果:1.U251細胞系在白藜蘆醇處理48h后,細胞出現(xiàn)皺縮、脫落,其生長明顯受阻,細胞數(shù)量顯著減少(85.7%)。LN428細胞系在白藜蘆醇處理后,與對照組相比,細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化,細胞數(shù)量未顯著減少。MTT顯示,白藜蘆醇處理48h的U251細胞的OD值(OD=0.310+0.020,細胞活性為50.1%),低于對照組(OD=0.618+0.103,p0.01);而LN428白藜蘆醇處理48h后(OD=0.743+0.047),細胞活性與對照組(OD=0.722+0.185,p=0.375)則無明顯差異。2.對外泌體進行的透射電鏡檢測顯示,提取液中含有大量30nm-200nm的橢圓形或圓形盤狀囊泡結(jié)構(gòu)。對外泌體進行WB檢測發(fā)現(xiàn),兩個細胞系分泌的外泌體中均存在特異性表達蛋白CD63,而β肌動蛋白則未被檢測到,說明本實驗成功富集樣品中的外泌體且無明顯其余細胞蛋白的污染。3.對用藥前后膠質(zhì)瘤細胞U251及LN428分泌外泌體進行的納米顆粒跟蹤分析發(fā)現(xiàn),所提取的外泌體直徑在30nm-200nm之間,呈散在分布或聚集成團。NTA外泌體定量分析提示,白藜蘆醇可使U251細胞的外泌體分泌增加4.2倍,而LN428細胞的外泌體分泌僅增加12.1%。4.外泌體與細胞共培養(yǎng)的MTT結(jié)果顯示,U251/N外泌體能提高LN428對白藜蘆醇的藥物敏感性(OD=0.624+0.027),而U251/Res外泌體(OD=0.703+0.047,p=0.043)與PBS對照組(OD=0.743+0.040,p=0.011)則不能。對于U251細胞,LN428/N外泌體(OD=0.295+0.020,p=0.145)和LN428/Res外泌體(OD=0.334+0.036,p=0.173)均不能改變U251對白藜蘆醇的敏感性。5.運用Label-free液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn),U251細胞外泌體有123種不同的蛋白質(zhì),而LN428細胞外泌體則達216種。U251/N外泌體具有更高的角蛋白(KRT包括KRT18,KRT19),H2A組蛋白家族成員X水平(H2AX包括H2AFX,HIST1H2AD),較低的Ras相關(guān)蛋白1(Rap1包括Rap1B,Rap1A),聚合物絲形成肌動蛋白水平(F-actin包括ACTB,ACTA2)和鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白包括GNAS,GNAI)。相反,LN428/N外泌體的蛋白質(zhì)組模式與U251/N外泌體的蛋白質(zhì)組模式不同,它表達較低的KRT,H2AX和較高的Rap1和F-肌動蛋白。白藜蘆醇可以通過改變KRT,H2AX,Rap1,F-肌動蛋白和G蛋白等蛋白的表達,進而改變U251和LN428細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)模式。6.基于GO功能聚類分析的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在生物過程中,U251/N外泌體在染色質(zhì)沉默和表皮發(fā)育中具有更高的表達,而U251/Res外泌體含有更多參與氧轉(zhuǎn)運、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路和細胞蛋白代謝過程的蛋白質(zhì)。分子功能分析表明,U251/N外泌體更多地作用在蛋白質(zhì)異二聚化活性和DNA結(jié)合。U251/Res外泌體蛋白在G蛋白復(fù)合物結(jié)合、脒基核苷酸結(jié)合和GTP酶活性上比U251/N外泌體有更高的表達。LN428/N外泌體與LN428/Res外泌體有多個共同參與關(guān)鍵生物過程和分子功能的蛋白質(zhì)。經(jīng)篩選,前5個生物過程分別是核小體組裝,基于微管的過程,染色質(zhì)沉默,細胞骨架組織和氧運輸。此外,分子功能活性中豐富度最高的是細胞骨架的結(jié)構(gòu)成分和酶活性(包括結(jié)構(gòu)分子活性,蛋白質(zhì)異二聚化活性,GTP酶活性和氧轉(zhuǎn)運活性)。7.借助KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示,U251/N外泌體可能通過調(diào)節(jié)Rap1信號通路與壞死性凋亡通路來增強耐藥的LN428細胞對白藜蘆醇的藥物敏感性。結(jié)論:1.白藜蘆醇敏感的膠質(zhì)瘤細胞U251在藥物處理后外泌活性更高。2.來自白藜蘆醇敏感U251膠質(zhì)瘤細胞的外泌體含有更多H_2AX和更低的Rab1,F-肌動蛋白和G蛋白,它能提高LN428對白藜蘆醇的藥物敏感性。3.白藜蘆醇可以增加處理膠質(zhì)瘤細胞的外泌體耐藥蛋白水平,而不論其藥物敏感性如何。
【圖文】：

示生長停滯和廣泛的細胞死亡。而在 LN428 細胞系，細胞狀態(tài)良好，形態(tài)未發(fā)生明顯改變，細胞群中較為旺盛（圖 1A）。 LN428 細胞系在白藜蘆醇處理后 MTT 檢測結(jié)果 U251、LN428 膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用使用 MTT 結(jié)果養(yǎng)組和 0.1%DMSO 處理組的細胞進行比較。MTT 細μM 白藜蘆醇處理 48h 的 U251 細胞的 OD 值（OD=0），與未受藥物處理的對照組（OD=0.618+0.103，p具有顯有統(tǒng)計學(xué)差異；而經(jīng)過 48h，100μM 白藜蘆醇0.743+0.047）和未處理細胞（OD=0.722+0.185，p =化。這些結(jié)果表明 U251 膠質(zhì)瘤細胞系對白藜蘆醇胞系。

圖 2. 支原體檢測：細胞 Hochest DNA 染色。U251 和 LN428 細胞制備外泌體及鑒定51 或 LN428 細胞的上清液中純化外泌體，定SO-處理的樣品為 DMSO/外泌體，白藜蘆醇處電鏡觀察U251及LN428兩細胞系提取的外泌的是差速超速離心法得到的外泌體，可見外形的膜結(jié)合囊泡。大小較均一，背景清晰，且僅析技術(shù)結(jié)果顯示，外泌體大小分布為 30nm-2粒跟蹤分析技術(shù)的外泌體定量結(jié)果顯示，白藜的 U251 細胞外泌體分泌增長 415.9％，，而對有 12.1％。對于上述方法分離得到的 2 種膠質(zhì)取蛋白，采用 Western Blot 實驗檢測外泌體標(biāo)
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41

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