發(fā)布時(shí)間：2020-06-12 04:16

【摘要】：目的惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,具有病程短、進(jìn)展快、預(yù)后差等特點(diǎn),目前的多種治療手段都無明顯的效果,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康,2年生存率不足30%。最近腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)的發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供了新的策略與方向。研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中存在著一群膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs),雖然含量極少,卻具有無限增殖、自我更新、多向分化和重建腫瘤的能力,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。因此殺滅膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可能成為治愈膠質(zhì)瘤的一種可行的手段。本課題組在前期蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)鈣結(jié)合蛋白S100A9在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中顯著上調(diào),靶向干擾S100A9后膠質(zhì)瘤增殖能力下降。S100A9蛋白屬鈣結(jié)合蛋白S100家族成員,廣泛參與細(xì)胞骨架構(gòu)建,鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、分化及炎癥反應(yīng)等,與腫瘤關(guān)系密切。本研究采用shRNA-S100A9慢病毒感染人U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,觀察U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新能力,并揭示其作用的潛在機(jī)制。方法構(gòu)建沉默S100A9基因的質(zhì)粒(含S100A9基因沉默序列3個(gè)和陰性對(duì)照序列1個(gè)),采用三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝沉默S100A9基因的慢病毒并感染人U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察感染后細(xì)胞綠色熒光表達(dá),嘌呤霉素對(duì)感染后的U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行篩選,獲取帶嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆進(jìn)行培養(yǎng)。通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)檢測(cè)S100A9mRNA的表達(dá),免役印跡技術(shù)(Western blot)檢測(cè)S100A9蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)分組如下:空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組�？瞻捉M:未作任何處理的U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組:shRNA-S100A9-1、shRNA-S100A9-2、shRNA-S100A9-3。MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外的增殖,干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力,RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果慢病毒感染后實(shí)驗(yàn)組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)受到明顯抑制。與對(duì)照組比較:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖變慢(P0.05),干細(xì)胞成球能力受到明顯抑制(P0.05),β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論靶向干擾S100A9后能夠明顯抑制U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外增殖、自我更新,其機(jī)制可能與抑制wnt/β-catenin信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān),提示S100A9可能作為膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

C D圖 1 U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞免疫熒光鑒定 100×(A:MERGE; B:DAPI; C:NESTIN; D:SOX-2)Fig. 1 Immunofluorescence Identification of U87 Glioma Stem Cells 100×(A:MERGE; B:DAPC:NESTIN; D:SOX-2)2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞熒光顯微鏡采圖（圖 2）

27D圖 2 慢病毒感染后各組細(xì)胞熒光表達(dá) 100×（A:sh-NC; B:shRNA-S100A9-1;C:shRNA-S100A9-2; D:shRNA-S100A9-3)Fig. 2 Cell fluorescence expression after lentivirus infection 100×（A:sh-NC;B:shRNA-S100A9-1; C:shRNA-S100A9-2; D:shRNA-S100A9-3)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4

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