目的:構(gòu)建重組人組織激肽釋放酶7(KLK7)表達(dá)載體,建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)KLK7的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3,并研究其細(xì)胞侵襲性。方法:將擴(kuò)增后的KLK7cDNA克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1上;使用限制性內(nèi)切酶酶切后,DNA測(cè)序驗(yàn)證。然后,通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3;選用G418進(jìn)行篩選,并擴(kuò)大培養(yǎng)每個(gè)單克隆細(xì)胞,進(jìn)而建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的KLK7單克隆細(xì)胞株P(guān)C-3;Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)了解其細(xì)胞侵襲性。結(jié)果:①通過(guò)酶切鑒定、DNA測(cè)序分析并證明,成功構(gòu)建pcDNA3.1-KLK7表達(dá)載體;②成功獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)KLK7的前列腺癌單克隆細(xì)胞株P(guān)C-3;③Western blot結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)pcDNA3.1-KLK7轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);④細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞侵襲性高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)論:成功的建立pcDNA3.1-KLK7表達(dá)載體及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)KLK7的前列腺癌PC-3單克隆細(xì)胞株,同時(shí)證明其細(xì)胞侵襲性,為研究KLK7在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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圖1pcDNA3.1-KLK7結(jié)構(gòu)及酶切位點(diǎn)位置示意圖

取抽提后質(zhì)粒實(shí)施酶切(KpnI限制性內(nèi)切酶),載體構(gòu)圖(圖1)。因KLK7開(kāi)放讀碼框、pcDNA3.1載體上各存在1個(gè)酶切位點(diǎn),因此酶切插入方向正確后電泳條帶顯示686bp(圖2)。對(duì)預(yù)期相符質(zhì)粒DNA測(cè)序驗(yàn)證。圖2載體KpnI限制性內(nèi)切酶酶切電泳圖

圖2載體KpnI限制性內(nèi)切酶酶切電泳圖

圖1pcDNA3.1-KLK7結(jié)構(gòu)及酶切位點(diǎn)位置示意圖2PC-3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的KLK7表達(dá)鑒定

圖3轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空載體細(xì)胞hK7表達(dá)比較

KLK7的細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3),40倍鏡放大下5個(gè)隨機(jī)視野,轉(zhuǎn)染的PC-3-KLK7細(xì)胞組平均細(xì)胞計(jì)數(shù)為(246.60±23.41)個(gè)/HP,對(duì)照的PC-3細(xì)胞組平均細(xì)胞計(jì)數(shù)為(109.00±8.75)個(gè)/HP,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。圖4....

圖4前列腺癌PC-3單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定過(guò)表達(dá)KLK7的細(xì)胞侵襲試驗(yàn)(結(jié)晶紫染色,×40倍)

圖3轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空載體細(xì)胞hK7表達(dá)比較討論

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