發(fā)布時間：2020-11-22 04:51

　　 研究背景腎移植是治療終末期腎病的最有效措施,但術(shù)后排斥反應(yīng)制約了其療效。隨著新型免疫抑制藥物的臨床應(yīng)用和并發(fā)感染的預(yù)防,提高了腎移植病人的短期生存率,然而長期服用免疫抑制劑,導(dǎo)致感染及惡性腫瘤的發(fā)生率明顯增加,影響了患者的長期存活。因此,尋找一種使機體產(chǎn)生免疫耐受的方法替代免疫抑制劑,既可以降低排斥反應(yīng)的發(fā)生率,同時避免長期服用免疫抑制劑帶來的不良反應(yīng),可能是改善腎移植的一種很有前途的方法。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細胞,在不同的誘導(dǎo)條件下,它們可以分化為多種組織,包括脂肪、骨、軟骨、肝和腎等。此外,骨髓間充質(zhì)干細胞具有低免疫原性和免疫抑制作用,并能優(yōu)先歸巢于損傷組織,促進組織修復(fù),但其改善能力有限,移植細胞向損傷腎臟的歸巢數(shù)量有限是影響修復(fù)效率的原因之一。促紅細胞生成素(EPO)是一種能調(diào)節(jié)紅系祖細胞生長分化的糖蛋白,其對于治療腎損傷的有效性已被廣泛證明。目前鮮有相關(guān)研究表明EPO是否會對BMSCs移植的定向腎臟歸巢及旁分泌有益,從而增強移植治療效果,降低腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生。本實驗對EPO預(yù)處理BMSCs后能否降低大鼠腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生率進行初步研究。目的構(gòu)建同種異體大鼠腎移植模型,經(jīng)尾靜脈注射促紅細胞生成素(EPO)預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),觀察BMSCs對預(yù)防大鼠腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的作用。方法1、腎移植模型的建立與分組選取SDF級體重(200～250)g的雄性SD、Wistar大鼠各24只,檢疫室預(yù)養(yǎng)3d,模型建立后隨機分為4組,每組6只,2%戊巴比妥鈉溶液(30mg/kg)腹腔注射麻醉,供腎用1%肝素水灌注蒼白后,低溫冰桶保存。分別麻醉供、受鼠后行原位腎移植手術(shù),術(shù)后開放血流,若腎臟充盈良好,血供豐富,且5分鐘內(nèi)不變黑,則關(guān)閉腹腔,成功建立大鼠腎移植模型。對照組(腎移植未干預(yù)組):大鼠腎移植模型建立后,未進行任何干預(yù);EPO干預(yù)組:腎移植建模后立即予1ml含有500IU的EPO尾靜脈注射;BMSCs移植組:腎移植建模后尾靜脈注射1ml含有1×106個BMSCs的PBS液;EPO-BMSCs組:腎移植建模后尾靜脈注射1ml經(jīng)EPO體外預(yù)處理的含有1×106個BMSCs的PBS液。各組大鼠均在溫度、濕度適宜的環(huán)境下飼養(yǎng),自由飲食、飲水。分別于建模后1d、5d處死部分大鼠(每次每組處死3只),下腔靜脈取血,分離血清后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?檢測血肌酐。腎移植術(shù)后1d、5d分別取受者雙側(cè)腎臟,新鮮標(biāo)本-80℃凍存,留做Western-blot檢測,10%甲醛固定標(biāo)本備作病理。2、血肌酐水平檢測腎移植術(shù)后,第1天和第5天,從腎移植大鼠取血標(biāo)本,分離血清,并用試劑盒檢測血清肌酐。3、組織病理學(xué)觀察組織標(biāo)本10%甲醛固定、石蠟包埋后,取5μm切片脫蠟至水,按常規(guī)方法分別行HE染色切片,每例切片在高倍鏡下(200×)隨機觀察10個互不重疊腎單位視野并拍照,分析炎癥及排斥反應(yīng)發(fā)生的可能性。4、Western Blot取腎組織80-100 mg加入1ml三去污裂解液,4℃20 000r/min離心10 min,取上清再次4℃12 000 r/min離心10 min,BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度,取30μg蛋白進行SDS-PAGE電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將PVDF膜放入4mL含5%的BSA/TBST室溫70rmp搖動封閉1h,加入4mL抗體/BSA稀釋液室溫孵育半小時后,4℃冰箱孵育搖床過夜,TBST洗膜,70rmp3次×10 min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1:2000)二抗,室溫搖動1h,洗膜3次×10min,置于伯樂化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像,CCD自動獲取圖片結(jié)果。采用ImageJ圖像分析軟件對獲得每個特異性條帶積分灰度進行半定量分析。測量條帶的灰度值,β-actin為內(nèi)參,各蛋白的表達強度為兩者灰度的比值。5、統(tǒng)計學(xué)分析方法計量資料采用均值±標(biāo)準差來表示,t檢驗用于分析兩組間的差異,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),需進行Student-Newman-Keuls方差齊性檢驗,用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,P0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、血肌酐水平大鼠腎移植術(shù)后第1天,與EPO-BMSCs組血肌酐水平相比,對照組、EPO組及BMSCs組血肌酐水平較高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);術(shù)后第5d,與EPO-BMSCs組血肌酐比較,對照組、EPO組及BMSCs組血肌酐水平較高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2、組織病理學(xué)檢查結(jié)果:移植后第1天,每組均發(fā)生炎癥反應(yīng),對照組3例中2例發(fā)生排斥反應(yīng),其余各組未發(fā)生排斥反應(yīng),但每個移植腎都是腫脹的。術(shù)后第5天,對照組3例和EPO組3例均發(fā)生排斥反應(yīng)。BMSCs組3例中有1例發(fā)生排斥反應(yīng),EPO-BMSCs組無急性排斥反應(yīng)。移植腎形態(tài)腫脹,急性排斥反應(yīng)發(fā)生時,移植腎呈暗紅色。3、Western Blot 結(jié)果Western Blot檢測表明,大鼠腎移植術(shù)后第一天,與EPO-BMSCs組相比,對照組、EPO組和BMSCs組的IFN-γ灰度值比值更高,但EPO-BMSCs組與BMSCs組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);術(shù)后第5天,與EPO-BMSCs組相比,對照組、EPO組和BMSCs組IFN-γ灰度值明顯升高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。大鼠腎移植后第1天,與EPO-BMSCs組比較,對照組、EPO組和BMSCs組IL-4灰度值比值更高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);腎移植術(shù)后第5天,與EPO-BMSCs組相比,對照組、EPO組和BMSCs組IL-4灰度值比值不同,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。腎移植術(shù)后第1天,與EPO-BMSCs組比較,對照組、EPO組和骨髓間充質(zhì)干細胞組(IFN-γ/IL-4)灰度值比值更高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);術(shù)后第5天,與EPO-BMSCs組比較,對照組、EPO組和BMSCs組的(IFN-γ/IL-4)灰度值比值明顯增高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論EPO預(yù)處理BMSCs可降低急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率,可能是通過增加注射的間充質(zhì)干細胞到達移植腎臟的數(shù)量,及調(diào)節(jié)相關(guān)免疫因子的表達,如調(diào)節(jié)IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4等的表達來調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡,改善腎移植微環(huán)境,來預(yù)防排斥反應(yīng)的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R699.2
【部分圖文】：

?Ｂ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｕｒｖｉｖａｌ?ｒａｔｅ?ｏｆ?ＢＭＳＣｓ?ｉｎ?ｄｉｆＦｅｒｅｎｔｌ?ＥＰＯ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ａｔ?２４ｈ?（Ａ）?ａｎｄ?ａｔ?４８ｈ?（Ｂ）??圖１－１在不同ＥＰＯ濃度下，ＢＭＳＣｓ的存活率在２４小時（Ａ）和４８小時（Ｂ）??表１－１Ａ在不同ＥＰ０濃度下，２４小時ＢＭＳＣｓ的存活率??組別（ＥＰ０濃度）?例數(shù)?存活率??０?３?１??１０?３?０．９８８９±０．００７１??１００?３?０．９８０４±０．０５２４??５００?３?０．?９５０２?±０．?０５６４??１０００?３?０．８４０５?±０．０２３５??各組相比，Ｐ＞０．?０５，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。??１６??

?ｐ－３Ｃｔｉｎ??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣＸＣＲ４?ｉｎ?ｔｈｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?５００ＩＵ／ｍｌ?ｏｆ?ＥＰＯ??圖１－４在５００ＩＵ／ｍｌ的促紅素濃度下，ＣＸＣＲ４蛋白的表達量??１８??

?１０００??Ｆｉｇ．?１－３?Ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?Ｓｃｒａｔｃｈ?ｔｅｓｔ?ｕｎｄｅｒ?ｔｈｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?（ｘ?ｌ〇〇）??圖１－３在顯微鏡下（ｘｌ〇〇）劃痕實驗圖像??４．３不同濃度促紅細胞生成素與ＢＭＳＣｓ共培養(yǎng)時，ＣＸＣＲ４的蛋白表達量??Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ分析表明，骨髓間充質(zhì)干細胞中ＣＸＣＲ４的蛋白表達在??ＥＰＯ－ＢＭＳＣｓ?組的灰度值比值（０．２５０１±０．００１）與?ＢＭＳＣｓ?組（０．２１２８±０．００３５）??相比大幅增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ＰＣ０．０５）。??ｇ〇．３－，?＊?ＥＰＯ－ＢＭＳＣｓ?ＢＭＳＣｓ??１?ｎ，?．？—■■■?ｇｒｏｕｐ?ｇｒｏｕｐ??＞?０．２－??２?卜：二?ＳＷｆｔＷ？??Ｉ－?ｍ?ｃｘｃＲ４?—?一—??１０?Ｊ?ｍｍ??＿?ＥＰＯＢＭＳＣｓ?Ｅ２３?ＢＭＳＣｓ?ｐ－３Ｃｔｉｎ??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＣＸＣＲ４?ｉｎ?ｔｈｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?５００ＩＵ／ｍｌ?ｏｆ?ＥＰＯ??圖１－４在５００ＩＵ／ｍｌ的促紅素濃度下，ＣＸＣＲ４蛋白的表達量??１８??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 湯勇;王帥;周訓(xùn)平;陳憲林;王曉芹;;間充質(zhì)干細胞免疫活性調(diào)節(jié)作用研究進展[J];重慶醫(yī)學(xué);2010年04期

2 楊光忠;陳文明;;間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能[J];中國全科醫(yī)學(xué);2009年16期

本文編號：2894148