發(fā)布時(shí)間：2020-10-29 09:12

　　 背景與目的 血紅蛋白病是一組常染色體隱性遺傳病,可分為地中海貧血和異常血紅蛋白兩類。地中海貧血的特征是珠蛋白肽鏈的合成減少；異常血紅蛋白表現(xiàn)為珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異常。少數(shù)的異常血紅蛋白,如異常血紅蛋白E(Hb E),也可以表現(xiàn)為地中海貧血的血液學(xué)表型。另外,遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)通常也被歸入“地中海貧血”一類中,這主要是由于它們常常與不同類型的地中海貧血復(fù)合遺傳,并對(duì)后者的表型起修飾作用。做為世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一,血紅蛋白病廣泛分布在世界的熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國(guó),見(jiàn)于長(zhǎng)江以南的多個(gè)省區(qū)。在這些地區(qū),其居高的發(fā)病率,已使血紅蛋白病所致的溶血性貧血成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。 廣西壯族自治區(qū)位于我國(guó)與越南北部接壤的西南沿海,是壯族人口在我國(guó)的主要聚居地,中國(guó)壯族人群中約95%(1538萬(wàn))的人口居于廣西,占廣西人口總數(shù)的32.7%。已有的研究顯示,廣西地區(qū)血紅蛋白病的攜帶率位居全國(guó)之首。但是,整個(gè)廣西地區(qū)及其不同民族中血紅蛋白病的流行狀況與分子特征,目前尚無(wú)徹底系統(tǒng)的研究。 本研究的主要目的是闡明血紅蛋白病在廣西地區(qū)的流行率以及不同基因型地貧共同遺傳的方式。我們采用基因型和血液學(xué)表型相結(jié)合的分析方法,系統(tǒng)分析了來(lái)自廣西6個(gè)地區(qū)5789份樣本的α-、β-和δ-珠蛋白基因,確定了血紅蛋白病在廣西地區(qū)的攜帶率和突變譜,并評(píng)估了血紅蛋白病在廣西不同地區(qū)與民族中的分布特點(diǎn)。此外,檢測(cè)過(guò)程中,我們首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了6例α-或δ-地貧新突變,以及2例在中國(guó)首次報(bào)道的6-珠蛋白基因突變。 材料與方法 1.人群樣本：根據(jù)廣西地區(qū)人口分布及民族構(gòu)成,共采集了廣西6個(gè)地區(qū)中12所中小學(xué)校的5789例廣西籍中小學(xué)生(男2841,女2948)的外周血樣本。漢族、壯族和瑤族樣本數(shù)的比例分別為58.1%、28.8%和10.7%,其它少數(shù)民族樣本占總樣本數(shù)的2.4%。 2.血液學(xué)分析：對(duì)所有樣本進(jìn)行了血常規(guī)和血紅蛋白組成分析。根據(jù)血液學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果,進(jìn)一步篩查標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧、β-地貧、δ-地貧和異常血紅蛋白的基因型。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧分子篩查的血液學(xué)指標(biāo)是：MCV80 fL,MCH27 pg,Hb A23.5%；β-地貧進(jìn)行分子篩查的血液學(xué)指標(biāo)是：①M(fèi)CV80 fL, MCH27 pg和Hb A23.5%；②表現(xiàn)出Hb E電泳帶；③Hb F5.0%。δ-地貧進(jìn)行分子篩查的血液學(xué)指標(biāo)是：①Hb A22.0%；②2.0%Hb A24.0%, MCV80 fL,MCH27 pg；異常血紅蛋白進(jìn)行分子篩查的表型指標(biāo)是：醋酸纖維膜電泳可見(jiàn)異常血紅蛋白電泳帶。 3.分子分析：用酚／氯仿方法提取基因組DNA。采用Gap-PCR技術(shù)、反向點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)α-地貧缺失突變和點(diǎn)突變；采用反向點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)β-地貧點(diǎn)突變；用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)檢測(cè)δ-地貧突變。采用多重連接酶探針擴(kuò)增反應(yīng)(MLPA)技術(shù)或DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)少見(jiàn)及未知的α-和β-珠蛋白基因缺失突變或點(diǎn)突變。所有β-地貧陽(yáng)性的樣本均檢測(cè)了α-地貧常見(jiàn)點(diǎn)突變和缺失突變。所有δ-地貧陽(yáng)性的樣本均檢測(cè)了α-地貧常見(jiàn)點(diǎn)突變和缺失突變及β-地貧常見(jiàn)點(diǎn)突變。異常血紅蛋白帶的所有樣品,均按照條帶的位置,分別進(jìn)行了α-、β-和δ-珠蛋白基因鏈的基因測(cè)序分析。采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的α2珠蛋白基因突變進(jìn)行功能分析。采用基于PCR的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)對(duì)δ-地貧新突變進(jìn)行β-珠蛋白基因簇單倍型分析。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：當(dāng)前人口和預(yù)計(jì)將來(lái)重型和中間型地貧出生人口的統(tǒng)計(jì)源數(shù)據(jù)來(lái)自于“廣西壯族自治區(qū)計(jì)劃生育人口通報(bào)”。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.O,采用Pearsonχ2檢驗(yàn)的方法比較不同民族和不同地區(qū)之間的地貧基因攜帶率,采用x2分割法將不同民族與地區(qū)間地貧攜帶率進(jìn)行多重比較。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法比較新突變基因和正�；�?qū)Ζ?珠蛋白基因mRNA水平的影響。用Hardy-berg平衡公式,計(jì)算不同地貧等位基因頻率和雜合子頻率,判斷該調(diào)查群體是否處于Hardy-berg平衡。 結(jié)果 血紅蛋白病的人群發(fā)病率 我們采用血液學(xué)表型和基因型相結(jié)合的分析策略,在5789例樣本中共檢測(cè)出α-、β-或δ-珠蛋白基因突變等位基因1419(24.51%)個(gè),包括α-地貧突變基因1016個(gè)(17.55%),β-地貧突變基因372個(gè)(6.43%),6-地貧突變9個(gè)(0.16%),異常血紅蛋白突變基因22個(gè)(0.38%)。370例β-地貧攜帶者中,79例(1.36%)檢測(cè)到同時(shí)攜帶有α-地貧,表現(xiàn)為29種不同的基因型組合。δ-地貧和異常血紅蛋白在廣西人群中的攜帶率較低,但表現(xiàn)出較多種類的基因型。此外,我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)了5種新突變及2種未曾在中國(guó)人群中報(bào)道過(guò)的少見(jiàn)突變。本研究為準(zhǔn)確的闡述各種血紅蛋白病在廣西人群中的發(fā)病率,將可致地中海貧血的常見(jiàn)異常血紅蛋白,按其突變基因分別歸類為α-地貧(Hb Westmead, Hb CS, and Hb QS)或β-地貧(Hb E)。 α-、β-或δ-地貧的突變譜 本研究總結(jié)并分析了1016個(gè)α-地貧等位基因和372個(gè)β-地貧等位基因的分子特點(diǎn)和及在不同民族和地區(qū)中的分布規(guī)律。在α-和β-地貧基因中,6個(gè)最常見(jiàn)的α-地貧突變和8個(gè)最常見(jiàn)的β-地貧突變分別占α和β珠蛋白肽鏈突變的98.9%和98.1%。漢族、壯族及瑤族的α-地貧和β-地貧的突變攜帶率分別為：15.71%(528／3361)和6.43%(261／3361)、20.12%(336／1670)和7.01%(117／1670)、20.84%(129／619)和5.17%(32／619),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)α-地貧在漢族和壯族之間、漢族和瑤族之間的攜帶率存在顯著性差異(p0.0001),而在壯族和瑤族之間沒(méi)有顯著性差異(p0.05)。β-地貧攜帶率在三個(gè)民族之間的沒(méi)有顯著性差異。同時(shí),我們分析了α-和β-地貧的發(fā)病率在廣西6個(gè)地區(qū)的分布特點(diǎn)。結(jié)果顯示,僅百色和賀州兩地區(qū)的α-地貧突變攜帶率比其它4個(gè)地區(qū)的α-地貧突變攜帶率要高(P0.05),α-地貧突變攜帶率在其它地區(qū)及β-地貧突變攜帶率在各地區(qū)之間均沒(méi)有顯著性差異(P0.05)。因在本研究中,只發(fā)現(xiàn)了9例δ-地貧,我們沒(méi)有在不同民族和地區(qū)之間進(jìn)行比較分析。根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果,我們認(rèn)為δ-130(A→G)和-77(T→C)在廣西地區(qū)應(yīng)該較為多見(jiàn)。 6種新突變和2種少見(jiàn)突變 本次研究我們發(fā)現(xiàn)了1種發(fā)生在α2-珠蛋白基因和5種發(fā)生在6珠蛋白基因的新突變。檢測(cè)到的α2-珠蛋白基因新突變?yōu)镃D13 (GCC→TCC), (HBA2:c.40 G→T, Genbank ID. GU145033),共2例。我們采集其中一個(gè)家系,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析突變對(duì)α-珠蛋白基因mRNA水平的影響。采用內(nèi)參和靶基因的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量的方法,內(nèi)參采用β-珠蛋白基因。突變組α-珠蛋白mRNA相對(duì)含量為0.229±0.103(n=5),正常對(duì)照組α-珠蛋白mRNA相對(duì)含量為0.162±0.229(n=5)。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,新突變不影響a-珠蛋白基因mRNA水平,因此,該突變應(yīng)該屬于靜止型突變或不引起地貧表型的異常血紅蛋白突變。 另外5種新突變均發(fā)生在δ-珠蛋白基因鏈上,分別為δ-130 (A→G) (HBD.c-180 A→G, Genbank ID GU145029)、-44 (G→A) (HBD.c-94 G→A, Genbank ID GU145030)、DEL-8～102 (HBD.c-58～52del, Genbank ID GU145032)、CD31 (CTA→TTA), (HBD.c 94 T→C, Genbank ID GU145031)、PolyA+6 (T→G), (HBD.c+136 T→G, Genbank ID GU145034)。我們采集到-130(A→G)、-44(G→A)、DEL-8～102突變家系各1個(gè)。采用RFLP技術(shù)對(duì)其進(jìn)行β-珠蛋白基因簇單倍型分析,結(jié)果顯示,-130(A→G)突變連鎖單倍型為“+------”,44(G→A)突變連鎖單倍型為“-++-+-+”,DEL-8～102突變連鎖單倍型為“-------”。 除此之外,兩例少見(jiàn)突變也是第一次在中國(guó)人群中報(bào)道,分別為位于δ-珠蛋白基因啟動(dòng)子的-77 (T→C) (HBD.-127 T→C),和可以形成異常血紅蛋白Hb A2-Melbourne的δCD43 (GAG→AAG)。 Hb Westmead的血液學(xué)特征 本研究中我們共檢測(cè)到89例(1.55%) Hb WS突變,其攜帶率僅次于—SEA、-α3.7和-α4.2,為最常見(jiàn)α-地貧非缺失型突變。89例Hb WS突變樣本中,11例(12.36%)合并β-地貧突變,5例合并α-地貧突變。為進(jìn)一步探討Hb WS的特征,我們對(duì)本研究中的76例Hb WS突變雜合子及62例來(lái)自于臨床實(shí)驗(yàn)室的攜帶有Hb WS突變的樣本依據(jù)α-基因型的不同進(jìn)行分組,然后比較各組之間的血液學(xué)參數(shù)。比較的結(jié)果顯示,大部分血液學(xué)參數(shù)在各組之間均表現(xiàn)出顯著性差異(P0.05)。當(dāng)Hb WS合并—SEA (—SEA/αWSα)時(shí),Hb WS可使地貧的表型加重,表現(xiàn)為Hb H病的特征。且對(duì)女性的影響似乎比對(duì)男性的影響更明顯。 討論 本研究調(diào)查了廣西地區(qū)血紅蛋白病的分子流行病學(xué)特征。結(jié)果顯示,血紅蛋白病在該地區(qū)的人群攜帶率高達(dá)24.51%,尤其是α-地貧的人群攜帶率達(dá)17.55%。從而首次明確了廣西地區(qū)α-地貧的攜帶率在中國(guó)南方是最高的,我們還首次報(bào)道了中國(guó)廣西地區(qū)δ-地貧的攜帶率(1.36%)。本研究闡述了廣西普通人群中的Hb H病及中間型地貧的攜帶率和基因型。此外,我們通過(guò)對(duì)5789例樣品全部進(jìn)行分子篩查的方法,首次準(zhǔn)確報(bào)道了三種常見(jiàn)的靜止型α-地貧突變(-α3.7,-α4.2和αWSα)在廣西地區(qū)的流行情況。與以往所進(jìn)行的研究通常基于病人而言,本研究通過(guò)血液學(xué)表型和基因型分析相結(jié)合的方式,首次確定了普通人群中血紅蛋白病的攜帶率。將我們的研究結(jié)果與已有的結(jié)果相比,α-和β-地貧均呈現(xiàn)出較高的攜帶率。我們認(rèn)為這一現(xiàn)象的原因主要是因?yàn)楸狙芯坎扇×讼冗M(jìn)技術(shù),以及明確了靜止型α-地貧的攜帶率。 本研究分析了血紅蛋白病在廣西地區(qū)三個(gè)主要的民族(漢、壯和瑤)之間的分布特點(diǎn)。除了α-地貧在漢族與壯族,漢族與瑤族之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外,α-地貧在壯族和瑤族及β-地貧在三個(gè)民族中的分布無(wú)顯著差別。我們認(rèn)為,這一結(jié)果應(yīng)該可以進(jìn)一步證明中國(guó)人群可能起源于同一個(gè)種族,壯族及瑤族與漢族之間α-地貧突變攜帶率的差異可能是遺傳漂變和居住地相對(duì)隔離及特殊風(fēng)俗如近親通婚等原因所致。同時(shí),通過(guò)分析血紅蛋白病在廣西不同地區(qū)的分布情況,我們可以看出α-、β-地貧的分布和攜帶率與G6PD缺乏癥相一致,從而進(jìn)一步證明α-、β-珠蛋白基因突變與G6PD基因突變可能同時(shí)有對(duì)抗瘧疾的作用。 根據(jù)我們的研究結(jié)果及目前廣西地區(qū)每年70萬(wàn)新出生人口,我們估算出在廣西地區(qū)每年可能生出重型或中間型β-地貧、Bart's水腫胎兒和Hb H病的患兒數(shù)分別是724(95%CI,603～897)、1095(95% CI,935～1337)和1327(95% CI,1148～1610),每1000次妊娠中,風(fēng)險(xiǎn)妊娠的概率分別是0.103%、0.156%和0.758%。 本研究的結(jié)果顯示,血紅蛋白病特別是α-和β-地貧在廣西地區(qū)已成為很嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我們的調(diào)查結(jié)果對(duì)于地貧的人群預(yù)防有以下指導(dǎo)意義：(1)α-和β-地貧在廣西地區(qū)均有一個(gè)比較窄的突變譜,6種常見(jiàn)的α-地貧突變和8種常見(jiàn)的β-地貧突變分別約占α-和β-地貧的99%和98%。我們可以據(jù)此設(shè)計(jì)經(jīng)濟(jì)有效的分子檢測(cè)方法。(2)α-復(fù)合β-地貧在廣西地區(qū)的攜帶率高達(dá)1.36%。因此遺傳咨詢時(shí),如果夫妻中一方有α-地貧或β-地貧時(shí),另一方都應(yīng)檢測(cè)α-地貧突變。(3)除了Hb CS, Hb QS, Hb WS、Hb E等能導(dǎo)致地中海貧血的異常血紅蛋白,其余的異常血紅蛋白以及δ-地貧在廣西地區(qū)的發(fā)生率比較低。δ-地貧在廣西人群中的攜帶率為0.16%,遠(yuǎn)低于意大利(2.5%)與塞浦路斯(1.47%)人群的攜帶率。因此我們認(rèn)為,δ-合并β-地貧所致的誤診現(xiàn)象在廣西地區(qū)應(yīng)該也比較少。在鑒別到的9種異常血紅蛋白類型中,僅Hb Q-Thailand表現(xiàn)出輕度的地中海貧血表型。進(jìn)行遺傳咨詢時(shí),應(yīng)予注意。(4)Hb H病和中間型地貧的預(yù)防在產(chǎn)前診斷中非常重要。兩種常見(jiàn)的基因型應(yīng)引起高度注意,一是--SEA／合并Hb WS突變(—SEA/αwsα)所致的Hb H�。欢怯搔�-地貧雜合子合并α-珠蛋白基因三聯(lián)體所致的中間型β-地貧。這兩種基因型均可以表現(xiàn)出由輕至重的表型多樣性。我們需要幫助高風(fēng)險(xiǎn)夫婦了解該病,并決定是否需要產(chǎn)前診斷或終止妊娠。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R181.3
【部分圖文】：

擴(kuò)增受阻3’ GCCACGT二5’圖3一 3ARMSPCR反應(yīng)原理與引物設(shè)計(jì)示意圖Rgure3一 ThePrinciPleandPrimersofARMS一PCR(2)ARMS一PCR反應(yīng)條件PeR反應(yīng)總體積為2501，含基因組 DNA10ong，0.2mmo比dNTp，各0.5協(xié)M上游和下游引物，10林 1ZxGCbuffer11，加入 3UTaq酶。熱循環(huán)參數(shù):95oC預(yù)變性3分鐘，95℃40秒、58℃45秒、72℃45秒共30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。反應(yīng)完后取5川PCR產(chǎn)物用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR是否成功。2.a一珠蛋白基因的反向點(diǎn)雜交技術(shù)的檢測(cè)盼B是通過(guò)位于等位基因特異性寡核營(yíng)酸 (allelespeeifieoligonueleotide

‘認(rèn)點(diǎn)落占占履疾內(nèi)，占禹久T令心圖3一 SM[LpA檢測(cè)突變膚失的技術(shù)原理Figure3一 5PrinciPleofMLPAdetection3.6.4家系回訪對(duì)于a一地貧表型陽(yáng)性，但經(jīng)過(guò)上述系統(tǒng)的基因型分析沒(méi)有查出基因異常的樣本，我們采用家系回訪的方法，聯(lián)系木人及其父母檢測(cè)血常規(guī)，觀察其父母和本人復(fù)查血常規(guī)的結(jié)果，了解其貧血是否有遺傳性因素所致，以排除其它原因所致的小細(xì)胞低色素貧血。3.6.5a一珠蛋白基因新突變分析通過(guò)上述系統(tǒng)的基因型檢測(cè)，我們檢測(cè)到2例樣本攜帶a一珠蛋白基因新突變 aZCD13(GCC*Tee)(HBAZ:e.400>T，oe曲毗In.Gu14s033)。采集其中1例樣本的家系外周血樣，并檢測(cè)其家庭成員的血液學(xué)表型和地貧基因突變，用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄 pCR(reversetranseriptpCR，RT-pCR)方法評(píng)估新突變對(duì)a-珠蛋白mRNA表達(dá)水平的影響。

一對(duì)引物擴(kuò)增正常a一珠蛋白基因的PcR產(chǎn)物為 1o02bP。檢測(cè)結(jié)果顯示，276例樣本攜帶有一己7，91例樣本攜帶有一己，，453例樣本攜帶有一SEA缺失。部分樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4一1。 23456M4一 1.A(一SEA)4一 1.C(一a42)圖4一1三種a一珠蛋白基因缺失(一sEA、一礦.7和一礦·2)PcR電泳檢測(cè)結(jié)果，依次見(jiàn)今LA，B和e。呱 udderDNAMar旋r，北京鼎國(guó)。4一4.A，2、3、5、7為一sEA缺失陰性結(jié)果;i、4、6均為一sEA缺失雜合子樣本。4一LB，7為一礦.7缺失陽(yáng)性結(jié)果，其它為陰性結(jié)果。4一Lc，4為一了.2缺失缺失陽(yáng)性結(jié)果
【引證文獻(xiàn)】

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