發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 09:57

　　 背景:急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是臨床工作中常見嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病,發(fā)展快,病死率高。ARDS患者常表現(xiàn)為呼吸困難和頑固的低氧血癥。盡管急性肺損傷在臨床上日益受到重視,但是目前仍缺乏有效的治療手段,尋找一個(gè)更加有效的新治療方法迫在眉睫。隨著人們對間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其作為成體干細(xì)胞,具有強(qiáng)大的增殖能力、多向分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)功能,可作為理想的種子細(xì)胞修復(fù)組織器官損傷,有研究表明其對ALI和ARDS的治療具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值,可能是一種潛在的、有前景的新治療方法。但是,肺損傷微環(huán)境中的高氧化應(yīng)激狀態(tài)很大程度上嚴(yán)重制約著外源MSC的修復(fù)功能。肺損傷微環(huán)境中可產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),移殖的MSC很容易暴露在高活性氧自由基環(huán)境中,從而過早的出現(xiàn)凋亡使定植于肺部的MSC數(shù)量減少,極大地影響了 MSC治療急性肺損傷的療效,因此,如何改善移植后微環(huán)境,提高移植細(xì)胞的存活率是目前MSC治療ALI/ARDS所要面臨的重要課題。還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)在線粒體氧化還原反應(yīng)中扮演核心角色。GSH是細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化物,近年來有大量研究表明GSH可以有效的治療器官的氧化應(yīng)激損傷,且已應(yīng)用于臨床。本課題基于MSC治療肺損傷,但是在肺部高氧化應(yīng)激狀態(tài)下,MSC容易出現(xiàn)過早凋亡,所以研究GSH能否有效提高M(jìn)SC的肺部定植率,使其在肺損傷高氧化應(yīng)激微環(huán)境中發(fā)揮更好的治療作用有重要意義。目的:探究還原型谷胱甘肽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化應(yīng)激保護(hù)作用及其對間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷的影響。方法:1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定:分離大鼠股骨及脛骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞,使用細(xì)胞貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測技術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物,應(yīng)用成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定MSC的多項(xiàng)分化潛能。2、觀察谷胱甘肽對高氧化應(yīng)激環(huán)境中MSC的影響:利用過氧化氫(1mmol/L)制作高氧化應(yīng)激損傷模型,使用還原性谷胱甘肽(5mmol/L)制作抗氧化模型。流式法觀察細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞內(nèi)ROS水平,蛋白免疫印跡(Western blot)測定細(xì)胞bcl-1、p53、p-jnk蛋白表達(dá)情況。3、肺損傷模型的建立和MSCs肺內(nèi)示蹤:利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)經(jīng)鼠尾靜脈注射建立大鼠ALI模型,再經(jīng)鼠尾靜脈注射染色劑標(biāo)記的MSCs。在MSCs注射后的15min,2h,24hand 72h幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別麻醉并處死大鼠,取出肺組織,利用小動(dòng)物成像儀分析MSCs在大鼠肺內(nèi)的留存情況,了解MSCs在大鼠肺內(nèi)的分布。4、病理評(píng)價(jià)及肺濕/干重比:各組大鼠處理后獲取全肺組織,左側(cè)肺葉制作石蠟切片并HE染色,右側(cè)肺葉測濕/干重。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,所有數(shù)據(jù)表達(dá)為X±SD,采用SPSS13.0分析軟件。單組計(jì)量資料采用t檢驗(yàn);3組以上獨(dú)立樣本采用單因素方差分析(One-way ANOVA),重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,P值小于0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)皿呈貼壁生長。CD29,CD44,CD90和CD105在細(xì)胞中呈陽性表達(dá),CD34和CD45呈陰性表達(dá)。成骨成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后染色可見脂肪小滴及骨組織。2、過氧化氫對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處理后,細(xì)胞存活率下降,凋亡率升高,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,p53、p-jnk蛋白表達(dá)水平上升,bcl-1蛋白表達(dá)水平下降;而谷胱甘肽組的細(xì)胞存活率上升,凋亡率降低,細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降,p53、p-jnk蛋白表達(dá)水平下降且bcl-1蛋白表達(dá)水平提高。3、染色標(biāo)記的MSCs經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi)后,可觀察到注射后15min時(shí)肺內(nèi)有大量的MSCs存留,隨后MSCs在肺內(nèi)逐步減少,72h肺內(nèi)依然有少量MSCs留存。GSH處理后的MSC在注射后的2h、24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)肺部定植率明顯高于對照組。4、大鼠尾靜脈注射LPS后,病理結(jié)果提示肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和肺泡間隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性滲出液減少和肺泡間隔變窄。肺組織濕/干重比在大鼠注入LPS后升高,在尾靜脈注入MSCs后濕/干重下降。GSH組的濕/干重比與對照組相比雖然數(shù)值較低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1、過氧化氫可導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,還原性谷胱甘肽能有效減少細(xì)胞內(nèi)ROS水平,并且通過影響相關(guān)蛋白的表達(dá)從而起到減少細(xì)胞凋亡的作用,具有氧化應(yīng)激保護(hù)機(jī)制2、GSH處理后的MSC在注射后的2h、24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)在肺部定植率明顯高于對照組,說明GSH在體內(nèi)也可明顯減少M(fèi)SC的凋亡。3、MSC對LPS介導(dǎo)的大鼠急性肺損傷有明顯的治療效果。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R563.8
【部分圖文】：

圖１．．分離培養(yǎng)早期可見細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，細(xì)胞呈放射樣生長，傳代后可見成熟的梭型大鼠骨髓充質(zhì)干細(xì)胞密集生長。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｍａｓｓ?ａｐｐｅａｒｅｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｅａｒｌｙ?ｓｔａｇｅ，?ｗｅ?ｃａｎ?ｏｂｓｅｒｖｅ?ｍａｔｕｒｅ?ｓｐｉｎｄｌｅ?ｂｏｎｅ?ｍａｒｒｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ?ｔｈａｔ?ｗｅｌｌ?ｇｒｏｗｉｎｇ．??２．２大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂及成骨分化??將第四代生長情況良好的ＭＳＣｓ放入成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，??按上文方法定期換液。成骨誘導(dǎo)１４天后用甲醛固定，茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)紅染的不規(guī)則鈣化組織（圖２Ａ）。成脂誘導(dǎo)１７天后，用甲醛固定，油紅溶液染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞中出現(xiàn)紅染的圓形脂肪小滴（圖２Ｂ）??

將第四代生長情況良好的ＭＳＣｓ放入成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，??按上文方法定期換液。成骨誘導(dǎo)１４天后用甲醛固定，茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中??出現(xiàn)紅染的不規(guī)則鈣化組織（圖２Ａ）。成脂誘導(dǎo)１７天后，用甲醛固定，油紅０??溶液染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞中出現(xiàn)紅染的圓形脂肪小滴（圖２Ｂ）??１４??

將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按上述方法經(jīng)ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、??ＣＤ９０、ＣＤ１０５等抗體孵育后，放入流式細(xì)胞儀中測試，發(fā)現(xiàn)ＣＤ２９，?ＣＤ４４，?ＣＤ９０??和ＣＤ１０５抗體呈高表達(dá)，而ＣＤ４５，ＣＤ３４抗體呈低表達(dá)（圖３）。??１５??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2869952