目的:本課題組前期通過慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的miRNA轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),miRNA-186-5p在COPD中表達存在差異,可能在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但其具體作用機制不明。進一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-186-5p可與lncRNA RP11-20G6.3及HIF-1α靶向結(jié)合。因此,本研究擬從細胞水平探究miRNA-186-5p在COPD中的生物學(xué)功能,并揭示miRNA-186-5p與lncRNA RP11-20G6.3及HIF-1α的靶向調(diào)控作用,初步在細胞水平探究lncRNA RP11-20G6.3對COPD發(fā)生的影響,同時在COPD患者血清中驗證lncRNA RP11-20G6.3表達水平,為揭示其分子機制提供理論依據(jù)。方法:(1)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)炎癥構(gòu)建人支氣管上皮(BEAS-2B)細胞模型。(2)分別合成miR-186-5p、lncRNA RP11-20G6.3低表達序列并轉(zhuǎn)染細胞,用CCK-8法檢測細胞增殖活性、流式檢測細胞凋亡及細胞周期;RT-qPCR檢測TNF-α、...

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略對照表
第1章 緒論
    1.1 慢性阻塞性肺疾病簡介
    1.2 miRNA在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展
    1.3 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展
第2章 實驗方法
    2.1 實驗主要儀器與試劑
        2.1.1 主要實驗儀器
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 引物與轉(zhuǎn)染序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 實驗對象與標本收集
        2.2.2 血液樣本采集
        2.2.3 RNA的提取
        2.2.4 RNA濃度測定
        2.2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 熒光定量PCR
        2.2.7 細胞總蛋白提取及濃度測定
        2.2.8 Western Blot
        2.2.9 ELISA
        2.2.10 細胞培養(yǎng)及LPS誘導(dǎo)炎癥模型建立
            2.2.10.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.10.2 脂多糖LPS誘導(dǎo)炎癥細胞模型構(gòu)建
        2.2.11 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.12 細胞增殖檢測(CCK-8法)
        2.2.13 細胞凋亡檢測(AnnexinV-FITC/PI法)
        2.2.14 細胞周期分析(PI染色法)
        2.2.15 lncRNA-miRNA靶基因預(yù)測與雙熒光素酶實驗驗證
        2.2.16 統(tǒng)計學(xué)方法
第3章 實驗結(jié)果
    3.1 miR-186-5p在 COPD中的功能研究
        3.1.1 miR-186-5p低表達/過表達BEAS-2B細胞系的建立
        3.1.2 LPS誘導(dǎo)的細胞COPD炎癥模型構(gòu)建
        3.1.3 構(gòu)建COPD炎癥模型中IL-6、TNF-ɑ的表達檢測
        3.1.4 低表達miR-186-5p檢測其表達改變對細胞行為的影響
            3.1.4.1 低表達miR-186-5p抑制BEAS-2B細胞增殖活性
            3.1.4.2 低表達miR-186-5p促進BEAS-2B細胞凋亡
            3.1.4.3 miR-186-5p對 BEAS-2B細胞周期的影響
        3.1.5 miR-186-5p對 BEAS-2B細胞NF-κB炎癥相關(guān)信號通路的影響
            3.1.5.1 qRT-PCR檢測miR-186-5p對BEAS-2B細胞對NF-κB炎癥通路基因表達水平的影響
            3.1.5.2 Western Blot檢測miR-186-5p對BEAS-2B細胞對NF-κB炎癥通路蛋白表達水平的影響
    3.2 LncRNA RP11-20G6.3在COPD中的功能研究
    3.3 miR-186-5p對 HIF-1ɑ和 LncRNA RP11-20G6.3 的調(diào)控作用探究
        3.3.1 miR-186-5p對 HIF-1ɑ的調(diào)控關(guān)系探究
            3.3.1.1 生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-186-5p與 HIF-1ɑ的靶向結(jié)合
            3.3.1.2 miR-186-5p低表達/高表達對HIF-1ɑ基因的影響
            3.3.1.3 miR-186-5p低表達/高表達對HIF-1ɑ蛋白的影響
            3.3.1.4 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-186-5p與 HIF-1ɑ的直接靶向關(guān)系
        3.3.2 LncRNA RP11-20G6.3對miR-186-5p的調(diào)控關(guān)系探究
            3.3.2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA RP11-20G6.3對miR-186-5p的靶向結(jié)合
            3.3.2.2 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-186-5p與 LncRNA RP11-20G6.3的直接靶向關(guān)系
    3.4 LncRNA RP11-20G6.3在COPD患者中的表達檢測
        3.4.1 樣本的一般特征
        3.4.2 qRT-PCR檢測外周血LncRNA RP1120G6.3 基因表達
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間的科研成果
致謝



本文編號：4001610