發(fā)布時間：2020-11-03 08:54

　　 背景和目的 Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)可特異性識別多種病原成份,啟動固有免疫反應(yīng),并進(jìn)一步誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。呼吸道感染及環(huán)境暴露因素對慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。作為固有免疫的重要組成部分,TLRs是連接環(huán)境暴露與適應(yīng)性免疫的重要橋梁,其在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用開始受到廣泛關(guān)注�，F(xiàn)有研究結(jié)果提示TLRs參與COPD的病理過程和免疫應(yīng)答,但對TLRs在COPD患者體內(nèi)實(shí)際表達(dá)情況和作用的研究很少。本課題在穩(wěn)定期COPD患者中,以健康不吸煙者、肺功能正常吸煙者、慢性持續(xù)期支氣管哮喘(簡稱哮喘)為對照,探討TLRs在COPD發(fā)生發(fā)展及炎癥特點(diǎn)中的作用;應(yīng)用A549肺上皮腫瘤細(xì)胞株,探討Th1相關(guān)細(xì)胞因子及糖皮質(zhì)激素治療對呼吸道上皮TLRs表達(dá)的調(diào)節(jié),從而進(jìn)一步明確TLRs在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用。 研究對象、方法 臨床研究部分 入選健康不吸煙者25例,肺功能正常吸煙者21例,穩(wěn)定期COPD患者30例,慢性持續(xù)期哮喘患者30例。其中穩(wěn)定期COPD患者均為吸煙者。應(yīng)用流式細(xì)胞儀全血免疫熒光直標(biāo)法檢測所有受試者外周靜脈血CD14+單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的TLR2、TLR4表達(dá)。所有受試者均檢測肺功能,COPD患行查痰培養(yǎng)、血清C反應(yīng)蛋白(CRP),應(yīng)用酶連免疫吸附法(ELISA)測定COPD和哮喘患者血清TNF-α、IL-8濃度。 實(shí)驗室研究部分 以A549人肺上皮腫瘤細(xì)胞株為實(shí)驗對象,分別單獨(dú)應(yīng)用Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α、地塞米松或聯(lián)合應(yīng)用地塞米松及上述細(xì)胞因子處理細(xì)胞,采用實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time PCR)法檢測A549細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6表達(dá)的變化情況。 研究結(jié)果 臨床研究部分 1.CD14+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率顯著高于中性粒細(xì)胞(P＜0.001)。CD14+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)與TLR4表達(dá)成正相關(guān)(P＜0.001)。CD14+單核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞間TLR2、TLR4表達(dá)成正相關(guān)(P＜0.05)。 2.COPD患者有24例留取合格痰標(biāo)本,其中16例細(xì)菌負(fù)荷量超過10~5CFU/ml,以革蘭氏陰性桿菌為主;CRP均處于正常水平。 3.健康不吸煙者、肺功能正常吸煙者及穩(wěn)定期COPD患者3組比較: a.外周血CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)在肺功能正常吸煙者中明顯下調(diào)(P＜0.05),在穩(wěn)定期COPD患者中進(jìn)一步顯著下降(P＜0.05)。 b.外周血中性粒細(xì)胞TLR2表達(dá)在肺功能正常吸煙者中明顯下調(diào)(P＜0.05),在穩(wěn)定期COPD患者中有進(jìn)一步下降趨勢(P＞0.05)。中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)情況3組間無明顯差異(P＞0.05)。 c.CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)強(qiáng)度,中性粒細(xì)胞TLR2的表達(dá)強(qiáng)度與FEV_1%預(yù)計值、FEV_1/FVC比值成顯著正相關(guān)(P＜0.001)。 4.慢性持續(xù)期哮喘患者CD14+單核細(xì)胞中TLR2及TLR4陽性細(xì)胞率明顯高于健康對照組(P＜0.01),中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)低于健康對照(P＜0.01)。CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)強(qiáng)度與哮喘患者血清IgE濃度有相關(guān)的趨勢。 5.COPD患者與哮喘患者的比較: a.COPD患者外周血中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)明顯高于哮喘患者(P＜0.05) b.COPD患者CD14+單核細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率顯著低于哮喘患者(P＜0.001)。 c.COPD患者血清IL-8濃度水平顯著高于哮喘患者,血清TNF-α濃度水平則低于哮喘患者(P＜0.01)。 d.外周血中性粒細(xì)胞TLR2及TLR4表達(dá)強(qiáng)度與血清IL-8濃度成正相關(guān)(P＜0.01),單核細(xì)胞TLR2及TLR4陽性細(xì)胞率與血清TNF-α濃度成正相關(guān)(P＜0.01)。 實(shí)驗室研究部分 1.IFN-γ使A549細(xì)胞TLR3表達(dá)明顯上調(diào),達(dá)對照組的3.78倍(P＜0.05)。 2.TNF-α使A549細(xì)胞TLR2、TLR6出現(xiàn)輕度上調(diào)(P＜0.05),分別達(dá)到對照的1.62倍和1.22倍。 3.地塞米松使A549細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)明顯上調(diào),分別達(dá)對照的3.27及3.43倍(P＜0.05)。 4.地塞米松與IFN-γ共同作用A549細(xì)胞時,TLR2表達(dá)顯著上調(diào),達(dá)對照的6.25倍,地塞米松與TNF-α聯(lián)合作用時TLR2表達(dá)增加至對照6.09倍(P＜0.05)。 5.TNF-α與IFN-γ聯(lián)合刺激A549細(xì)胞時,TLR2上調(diào)達(dá)對照的3.66倍,而地塞米松與TNF-α、IFN-γ三者共同作用A549細(xì)胞時,TLR2的表達(dá)出現(xiàn)十分顯著的上調(diào),達(dá)對照的29.81倍(P＜0.05)。 結(jié)論 1.健康人群單核細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)顯著高于中性粒細(xì)胞。 2.吸煙抑制單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLRs表達(dá)。 3.COPD患者單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLRs表達(dá)受到抑制,TLRs表達(dá)下調(diào)與病情進(jìn)展有關(guān)。 4.COPD患者TLRs的表達(dá)狀態(tài)與其炎癥反應(yīng)特點(diǎn)有關(guān)。 5.Th1細(xì)胞因子及糖皮質(zhì)激素上調(diào)呼吸道上皮細(xì)胞TLRs表達(dá),二者對呼吸道上皮細(xì)胞TLR2表達(dá)的上調(diào)具有協(xié)同作用,提示吸入激素治療可能增強(qiáng)COPD患者氣道上皮防御功能。
【學(xué)位單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

離心分離血清，分裝后保存于一80℃冰箱。(二)流式細(xì)胞檢測1.樣本處理采新鮮血樣后4小時內(nèi)處理。取EDTA抗凝全血300協(xié)L，分裝3管。每CD14一FITc單抗(6lD3，10林創(chuàng)inl)。試驗管分別加抗TLRZ一pE(TLZ.l，10和抗TLR4一PE(H認(rèn)一25，10林g/]間);對照管加同型對照IgG2a(lo林創(chuàng)回)，光孵育30分鐘。每管加溶紅素1而，震蕩器充分混勻，避光室溫孵育10分心棄上清，PBs洗滌2次，重懸于1%多聚甲醛固定液200匹中，應(yīng)用FACSc流式細(xì)胞儀獲取細(xì)胞，每管樣本至少獲取5000個目標(biāo)細(xì)胞。2.細(xì)胞獲取單核細(xì)胞:用FSC/SSC設(shè)定單核細(xì)胞門Rl，根據(jù)CD14表達(dá)情況畫出陽性門R2，從Rl及R2門的交集即CD14+單核細(xì)胞中獲取TLRS抗體染色陽胞。見圖1。宕O一8.

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博十研究生學(xué)位論文中性粒細(xì)胞:用FSC/SSC設(shè)定粒細(xì)胞門RI，從中獲取TLRs抗體染色陽性細(xì)胞。見圖2，，·八價R’ ’義 義一必、 /// ...二戒半夯一擴(kuò) 擴(kuò) ....二’:·、.:扛丁少二 二擠擠滬一 一00口00寸蘭一幼.不公55FSC一e一ght圖2中性粒細(xì)胞流式檢測設(shè)門圖3.CellQuest軟件數(shù)據(jù)分析根據(jù)同型對照獲取情況設(shè)定獲取條件，使協(xié)樣本獲取時均處于相近條件卜。根據(jù)同型對照位置設(shè)定陰性細(xì)胞區(qū)Ml及陽性細(xì)胞區(qū)MZ，記錄TLRs表達(dá)平均熒光強(qiáng)度(mfi)及TLRS陽性細(xì)胞率。見圖3。0000007060悶 01999999999999999999。07060悶 0200000000000007060悶 .0211111111111:::日甄萬 {一 一:日荻范二 {加 加、兄)石率 }翩 翩甘甘1.司司 司 司奮刁 11LJ~11氣 氣氣…匕裁嗽‘二二二ee，~.二二二翻山抽抽心.曰 曰八八八O‘L一一一--二盞-.一一.一JJJ0勺 1匕毛l飛一一 一一 UUIU已 EEEEUIU IIIIIUIU!U{UIUUUUU._〕八一 }}}}}}}}}}}}}}}}幾 R4PEEEE喃喃喃喃喃 useeIgGZaaPEEEEEEEEE。戈咐挽嘆呼叮州 ;;;;;;;;;{{{{{o

4陽性細(xì)胞率較高(P<0.OS)。見表1，圖1。表1CD14+單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞TLRZ、TLR4表達(dá)情況TLRZm五TLRZ耳沁P(o/.)TLR4m6幾R4耳姆P(，/o)14+M11.以士2.4382.7狂l7.9()PM入2.21士0.5222.10士16.751.99士0329.!6士6.40計值尸值17.7712.388.502一2.0910.以K)0.(XX)0.《以】0.042為TLRs相對平均熒光強(qiáng)度，rpCp為TLRS陽性細(xì)胞相對百分率，M代表單核中性粒細(xì)胞。100.的
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 鄧鴻杰;COPD患者外周血單個核細(xì)胞TLR4表達(dá)及血清GRP檢測的臨床意義[D];川北醫(yī)學(xué)院;2012年

本文編號：2868364