發(fā)布時間：2020-12-04 00:58

　　核酸適配體（aptamer）是通過體外篩選技術,即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）得到的單鏈DNA或RNA。核酸適配體被稱為“化學抗體”,有著與蛋白抗體相同的識別機制,并且,較蛋白抗體具有一定的優(yōu)勢:可直接通過化學合成并能根據(jù)要求對其修飾;親和力高,結合解離常數(shù)甚至可達到納摩爾級;結構穩(wěn)定,便于保存等。利用活的腫瘤細胞為靶標的cell-SELEX技術,能夠在靶標分子未知的前提下,篩選得到識別腫瘤細胞的核酸適配體,直接用于腫瘤的診斷及治療。本論文利用cell-SELEX技術篩選靶向腫瘤細胞的核酸適配體,對核酸適配體進行結構分析和性質(zhì)表征,并嘗試利用這些核酸適配體開發(fā)腫瘤的診斷和治療新方法,具體研究如下:耐藥型的卵巢癌細胞的篩選及表征:以紫杉醇耐受的卵巢癌細胞A2780T作為篩選的靶細胞,野生型卵巢癌細胞A2780作為反篩細胞,篩選出選擇性識別A2780T細胞的核酸適配體HF3和HA5。對其進行序列優(yōu)化及表征,得到具有高親和力的核酸適配體HF3-58和HA5-68,進... 

【文章來源】：湘潭大學湖南省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

SELEX基本篩選過程[9]

?＼?ｌａｓ：?ＳＥＬＥＸ??＼一?．★＊．??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??圖１．１?ＳＥＬＥＸ基本篩選過程［９］??１．３．２?ＳＥＬＥＸ技術的分類??１．３．２．１傳統(tǒng)篩選方法??利用傳統(tǒng)的ＳＥＬＥＸ技術，篩選得到核酸適配體需要幾周甚至是一個月的時??間［９］，基本原理見圖１．２。通過化學合成的寡核苷酸文庫用于核酸適配體的篩選，??此文庫中的寡核苷酸一般由中間隨機序列和兩端固定的引物序列構成。傳統(tǒng)的??ＳＥＬＥＸ篩選方法中的篩選步驟取決于篩選的核酸適配體的類型。對于ＤＮＡ型的??核酸適配體，通過化學合成的ＤＮＡ文庫直接與靶標分子孵育，然后將與靶標分??子不結合的序列洗掉，再分離靶分子與結合的ＤＮＡ，經(jīng)過ＰＣＲ將分離出的結合??的ＤＮＡ序列進行擴增再進行下一輪的篩選。通過一系列篩選得到潛在的核酸適??配體，進一步通過多種研究方法確定其序列及其動力學。對于ＲＮＡ型的核酸適??配體，增加了體外轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的步驟，將一個ＤＮＡ文庫先要轉(zhuǎn)錄成ＲＮＡ文??庫，篩選過程與ＤＮＡ型的一致，結合后的ＲＮＡ序列分離出來之后將其反轉(zhuǎn)錄??成ＤＮＡ序列

圖１．３毛細管電泳ＳＥＬＥＸ技術示意圖［９］??１．３．２．３基于磁珠的ＳＥＬＥＸ技術??利用磁珠固定靶分子的ＳＥＬＥＸ技術（圖１．４）在１９９７年被提出。該方法是??將靶分子固定在磁珠上與寡核苷酸的文庫進行孵育，通過磁力分離器將靶蛋白與??核酸適配體的結合混合物從不結合的寡核苷酸分離出來，然后通過熒光顯微鏡定??性與靶蛋白結合的核酸適配體，利用流式細胞術進行定量。２００５年一種更方便??更容易的ＦｌｕＭａｇ－ＳＥＬＥＸ［３８］方法被提出，ｎｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ技術的原理是基于目標??磁珠固定化：第一輪選拔后，單鏈ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增并標記熒光素修飾引物??量化下一步的篩選的核酸適配體；然后將獲得的寡核苷酸克隆并測序。富集后的??核酸適配體的解離常數(shù)可以通過熒光測定。使用此方法得到了鏈和青霉素［３８］，異??丁苯丙酸［３９］和多氯聯(lián)苯＿的核酸適配體。Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳＥＬＥＸ是Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ等人在??２０１２年提出的基于ＦｌｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ的新方法。其區(qū)別在于將固定靶分子替代為??磁珠固定篩選ＤＮＡ文庫，這樣的修改是針對篩選不能被固定的小分子，如同??ＦｌｕＭａｇＳＥＬＥＸ篩選一樣每輪篩選后進行熒光標記使得可通過熒光定量�；�于該??方法篩選得到的核酸適配體的靶分子有卡那霉素


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