發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 05:38

　　 “胸痹”是以胸部悶痛、胸痛徹背、氣短喘息、心悸等癥為主的一種疾病。中醫(yī)認(rèn)為一切能引起胸部“滿、悶、疼、痛”一類的疾病,都可稱作胸痹。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病、心絞痛、心肌缺血)與其關(guān)系密切,均歸于“胸痹”范疇。《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則2002版》將胸痹分為氣滯血瘀型、氣虛血瘀型、寒凝氣滯型、心血瘀阻型、心腎陰虛型、痰阻心脈型、陽氣虛衰型和氣陰兩虛型等8類主要證型。氣滯血瘀、氣虛血瘀與寒凝氣滯型胸痹為臨床主要高發(fā)證型,備受研究關(guān)注。目前大多研究是從一個(gè)或幾個(gè)生化指標(biāo)與不同證型的關(guān)系切入,然而由于證的整體性、動(dòng)態(tài)性和異病同證、同病異證等特征,難以用單一或少數(shù)指標(biāo)做完整、全面的闡釋,難以體現(xiàn)疾病的整體性和系統(tǒng)性,不能反映中醫(yī)證候的本質(zhì)。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,能夠獲得生化表達(dá)的終端信息,最具備反映和解決證型代謝物“組”、“群”、“譜”集成的分析功能。代謝組學(xué)能夠?qū)�機(jī)體的整體狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)分析,根據(jù)從不同個(gè)體樣本獲取的海量信息,構(gòu)建數(shù)據(jù)模型,進(jìn)行多關(guān)系、多角度度量、分類及預(yù)測(cè)。遵循整體性、動(dòng)態(tài)性原則,獲得較為深入的證型相關(guān)潛在生物標(biāo)志物及代謝通路信息。本課題基于超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)分析方法對(duì)氣滯血瘀型胸痹、氣虛血瘀型胸痹和寒凝氣滯型胸痹進(jìn)行辨證分型并尋找其潛在生物標(biāo)志物及相關(guān)代謝通路的研究�；�于代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)氣滯血瘀型、氣虛血瘀型與寒凝氣滯型胸痹證的研究進(jìn)展:查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),梳理匯總氣滯血瘀型、氣虛血瘀型、寒凝氣滯型的模型制備方法。采用長期束縛刺激與皮下注射腎上腺素聯(lián)合、疊加皮下注射異丙腎上腺素方法制備氣滯血瘀胸痹大鼠模型:采用長期強(qiáng)迫力竭游泳、疊加皮下注射異丙腎上腺素方法制備氣虛血瘀型胸痹大鼠模型;采用冰凍、疊加皮下注射異丙腎上腺素方法制備寒凝氣滯型胸痹大鼠模型。整理綜述了代謝組學(xué)研究技術(shù)及代謝組學(xué)對(duì)3種證型胸痹的研究報(bào)道。代謝組學(xué)技術(shù)在新藥藥效研究、毒性評(píng)價(jià)和疾病診斷等諸多領(lǐng)域廣泛開展并取得豐碩成果。它作為一種系統(tǒng)研究方法能在鑒別生理、病理模型上發(fā)揮重要作用�？梢暂^為系統(tǒng)全面的反映生物有機(jī)體代謝產(chǎn)物的變化,實(shí)現(xiàn)通過代謝組學(xué)方法尋找胸痹不同中醫(yī)證型間代謝物的異常。代謝組學(xué)技術(shù)是本課題研究的基礎(chǔ),通過綜述其他學(xué)者運(yùn)用代謝組學(xué)對(duì)3種胸痹證的研究,旨在為實(shí)驗(yàn)的后續(xù)工作提供系統(tǒng)的文獻(xiàn)整理和參考。本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.氣滯血瘀型、氣虛血瘀型、寒凝氣滯型胸痹證模型建立及基礎(chǔ)指標(biāo)檢測(cè)以氣滯血瘀型、氣虛血瘀型、寒凝氣滯型胸痹大鼠為研究對(duì)象,比較不同中醫(yī)證型在宏觀癥狀、全血粘度、血脂、心肌酶、心電圖、心臟組織病理切片和血液微循環(huán)等多個(gè)系統(tǒng)生物學(xué)指標(biāo)的差異,并針對(duì)氣滯血瘀型、氣虛血瘀型和寒凝氣滯型胸痹大鼠選擇“方證相應(yīng)”的冠心丹參方、通心絡(luò)方與冠心蘇合方給予藥物治療,比較經(jīng)藥物干預(yù)后血脂、心肌酶和病理切片指標(biāo)的變化。具體實(shí)驗(yàn)方法如下,氣滯血瘀型造模:大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1w環(huán)境預(yù)適應(yīng)后,轉(zhuǎn)為大鼠高脂飼料喂養(yǎng)2 w。之后放于大鼠固定器中每天束縛4 h,連續(xù)操作12 d。12 d后頭部皮下注射腎上腺素0.8 mg·kg-1,每天1次,連續(xù)2d。氣虛血瘀型造模:大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1w環(huán)境預(yù)適應(yīng)后,轉(zhuǎn)為大鼠高脂飼料喂養(yǎng)2w。然后每天同一時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)迫大鼠游泳至筋疲力盡撈出(大約30min),相同操作連續(xù)進(jìn)行14 d。寒凝氣滯型造模:大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1w環(huán)境預(yù)適應(yīng)后,轉(zhuǎn)為大鼠高脂飼料喂養(yǎng)2 w。然后每天同一時(shí)間點(diǎn)放入-20℃冰柜冰凍4 h,相同操作連續(xù)進(jìn)行7d。3種胸痹證型的中醫(yī)證型部分造模完成后,疊加心肌缺血造模操作,期間持續(xù)喂飼高脂飼料至模型制備完成。異丙腎上腺素(ISO)以:2、4、4mg·kg-1劑量順序連續(xù)3d皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行心肌缺血模型制備。繼而以氣滯血瘀型、氣虛血瘀型、寒凝氣滯型胸痹大鼠為研究對(duì)象,測(cè)定不同證型的全血粘度、血脂、心肌酶、心電圖、心肌組織病理切片和血液微循環(huán)等多個(gè)系統(tǒng)生物學(xué)指標(biāo)。心電圖、心肌酶、HE染色病理切片結(jié)果表明,各組大鼠心肌缺血操作造模成功。血脂檢測(cè)結(jié)果顯示,3種證型大鼠血液呈現(xiàn)“濃、粘”狀態(tài)。氣滯血瘀與氣虛血瘀組在高、中、低切變率的增長幅度高于寒凝氣滯組切變率增長幅度,血瘀效果明顯。微循環(huán)測(cè)定結(jié)果顯示,寒冷刺激是微循環(huán)障礙的重要且必要造模因素。氣滯血瘀型組與氣虛血瘀型組模型的造模過程也呈現(xiàn)出一定的微循環(huán)障礙。給予相應(yīng)的藥物干預(yù)后,血脂、心肌酶和心臟病理切片等指標(biāo)有回調(diào)趨勢(shì)。從模擬病因、癥狀表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)指標(biāo)檢測(cè)、對(duì)應(yīng)方藥干預(yù)等方面驗(yàn)證三種中醫(yī)胸痹證型模型建立成功。2.基于代謝組學(xué)技術(shù)尋找三種胸痹證型特征性潛在生物標(biāo)志物的研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)分析方法,對(duì)三種中醫(yī)胸痹證型大鼠血漿進(jìn)行代謝組學(xué)研究。將預(yù)處理的UPLC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件包,進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA),以降維模式觀察、識(shí)別可能的異常樣品及樣品之間的聚類趨勢(shì)。再利用正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)鑒定各組潛在生物標(biāo)志物。將篩選到的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行t檢驗(yàn)并驗(yàn)證其組間差異,VIP1,P0.05認(rèn)為有顯著性差異。28個(gè)差異代謝物被鑒定為與氣滯血瘀型胸痹相關(guān)的潛在標(biāo)志物;21個(gè)差異代謝物被鑒定為與氣虛血瘀型胸痹相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物;23個(gè)差異代謝物被鑒定為與寒凝氣滯型胸痹相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。3種中醫(yī)證型的潛在生物標(biāo)志物在維恩圖中重疊,鑒別到3種中醫(yī)證型的特征性潛在生物標(biāo)志物。并進(jìn)一步研究挖掘了與相應(yīng)證型關(guān)系密切的代謝途徑。三種中醫(yī)證型特征性潛在生物標(biāo)志物在氨基酸代謝、脂肪酸合成、脂肪酸β氧化代謝、膽汁酸代謝、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、脂肪酸酰胺代謝和維生素B6等代謝途徑發(fā)生代謝紊亂。半胱氨酸和蛋氨酸代謝、色氨酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝是氣滯血瘀型胸痹代謝紊亂的主要途徑,一系列氨基酸代謝紊亂與氣滯血瘀型相關(guān)性最高�；ㄉ�四烯酸代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸β氧化代謝和維生素B6代謝是氣虛血瘀型胸痹代謝紊亂的主要途徑。賴氨酸的合成與降解、脂肪酸的代謝及甘油磷脂的代謝是寒凝氣滯型代謝紊亂的主要途徑。氨基酸類代謝物可為能量代謝提供底物,能量代謝紊亂,能量運(yùn)行障礙有可能導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢,血滯成瘀,能量代謝紊亂嚴(yán)重影響著氣滯血瘀型的發(fā)生和發(fā)展。花生四烯酸引起的炎癥反應(yīng)和脂肪酸酰胺引起的能量代謝紊亂和維生素B6代謝紊亂影響色氨酸的代謝間接影響能量代謝紊亂致使因氣虛而無力推動(dòng)血液運(yùn)行障礙導(dǎo)致血液瘀阻癥狀產(chǎn)生。氨基酸代謝和脂肪酸代謝都嚴(yán)重影響能量代謝,兩部分的能量代謝紊亂影響寒凝氣滯型的發(fā)生發(fā)展,參與甘油磷脂代謝的溶血磷脂酰膽堿在炎癥性疾病中扮演重要的角色,說明嚴(yán)重的能量代謝的紊亂和炎癥反應(yīng)與寒邪侵襲以致氣血運(yùn)行不暢導(dǎo)致寒凝氣滯型的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。3.基于代謝組學(xué)技術(shù)以“方證相應(yīng)”反證方法驗(yàn)證潛在生物標(biāo)志物及代謝通路研究應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù),采用UPLC-Q-TOF/MS方法,對(duì)氣滯血瘀型、氣虛血瘀型與寒凝氣滯型胸痹大鼠進(jìn)行“方證相應(yīng)”方藥干預(yù)研究。以“反證”模式驗(yàn)證三種中醫(yī)證型胸痹動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上,深入探析三種胸痹證型的特有、共有潛在生物標(biāo)志物,揭示相應(yīng)代謝通路的特征性變化趨勢(shì),實(shí)現(xiàn)以代謝組學(xué)視角表征三種胸痹證型,發(fā)掘其內(nèi)在規(guī)律。通過不同復(fù)合因素刺激大鼠,建立3種胸痹證模型。針對(duì)氣滯血瘀型胸痹、氣虛血瘀型胸痹和寒凝氣滯型胸痹選擇相應(yīng)的冠心丹參方、通心絡(luò)方與冠心蘇合方進(jìn)行藥物干預(yù)治療。運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行分析,以降維模式觀察、識(shí)別可能的異常樣品及樣品之間的聚類趨勢(shì),結(jié)合判別分析方法進(jìn)行分類與反證動(dòng)物模型。給藥組與模型組相較,其代謝物輪廓向空白對(duì)照組回調(diào),藥物反證模型有效。藥物干預(yù)后,能校正鑒別到的三種證型受影響的多數(shù)潛在生物標(biāo)志物代謝水平,改善生物標(biāo)志物參與的相應(yīng)代謝通路的紊亂。氣滯血瘀型大鼠氨基酸代謝紊亂得到改善,緩解了因疾病原因造成ATP合成不足而使能量代謝產(chǎn)生的紊亂和因能量運(yùn)行障礙導(dǎo)致的氣血運(yùn)行不暢。氣虛血瘀型大鼠中脂肪酸代謝紊亂得到改善,緩解能量運(yùn)行障礙和因氣虛無力推動(dòng)血液運(yùn)行障礙導(dǎo)致的血液瘀阻癥狀。寒凝氣滯證大鼠中賴氨酸的降解和合成代謝得到改善,寒冷刺激使能量代謝產(chǎn)生紊亂,藥物干預(yù)后改善了能量代謝紊亂和因能量運(yùn)行障礙導(dǎo)致的血液凝滯癥狀。通過“方證相應(yīng)”反證方法驗(yàn)證模型的成功建立,同時(shí)驗(yàn)證了鑒別生物標(biāo)志物的可靠性。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

１．３代謝組學(xué)研究流程??代謝組學(xué)的分析技術(shù)主要包括核磁共振和質(zhì)譜色譜聯(lián)用兩大類，其中液質(zhì)聯(lián)??用技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，基于液質(zhì)聯(lián)用的典型代謝組學(xué)技術(shù)研究流程［２１］如下圖１．１??所示。??代謝組學(xué)研宄??采集血漿??ＵＰＬＣ?ＩＱ－ＴＯＦ－ＭＳ??提取內(nèi)源性代謝物??Ｍａｓｓ｜Ｌｙｎｘ??數(shù)據(jù)解析Ｓ１ＭＣＡ－Ｐ??１?＾??ＰＣＡ?ＰＬＳ－ＤＡ?ＯＰＬＳ－ＤＡ??、???－囑似丨：郵賺妳熱欲燦嫌？細(xì)？咖痛撕》義油＿丨》而咖和■■咖？咖??尋找潛在生物標(biāo)志物??：，??代謝通路分析??Ｉ??生物學(xué)意義闡釋??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｙｐｉｃａｌ?ｗｏｒｋｆｌｏｗ?ｏｆ?ＬＣ－ＭＳ?ｂａｓｅｄ?ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ??圖１．１基于ＬＣ－ＭＳ的代謝組學(xué)的典型研究流程??１．４數(shù)據(jù)處理方法??１４??

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院?碩士研宄生學(xué)位論文??預(yù)適應(yīng)后，轉(zhuǎn)為大鼠高脂詞料喂養(yǎng)２?ｗ，然后每天同樣時(shí)間放入－２０°Ｃ冰柜冰凍４??ｈ，共冰凍７?ｄ。證型部分造模完成后，疊加心肌缺血模型造模方法，整個(gè)模型模完成，且高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)至整個(gè)模型造模完成。??

ｉ１５－?ｉｉｉｉ??＿＿＿ｇ＿??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｗｉｔｈ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓｈｅａｒ?ｒａｔｅ?ｏｆ?ｗｈｏｌｅ?ｂｌｏｏｄ?ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ??圖２．３各組大鼠不同切變率全血粘度??血瘀證具有濃、粘、凝、聚幾個(gè)特點(diǎn)，血液的粘滯和流動(dòng)性改變被視為中醫(yī)??血瘀證診斷的微觀指標(biāo)［１６］。全血粘度值分析：與空白對(duì)照組相比，氣滯血瘀、氣??虛血瘀、寒凝氣滯組血液流變學(xué)參數(shù)全血粘度高切、全血粘度中切、全血粘度低??切均有不同程度的升高。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〇Ｐ＜〇．〇５），心肌缺血組也有一定的升??高。與空白對(duì)照組比較，氣滯血瘀組、氣虛血瘀、寒凝氣滯組在２０?ｓ－１低切變率??的全血粘度增長率分別為：５８．８％
【參考文獻(xiàn)】

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