第一部分 RSV感染裸鼠模型的建立及病理特征分析目的：呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)感染是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,至今缺乏安全有效的防治措施。適應(yīng)性免疫及固有免疫均參與RSV致病,其中適應(yīng)性免疫的作用得到了較好的闡釋。近年來(lái),固有免疫應(yīng)答在多種疾病中的作用越來(lái)越引起重視,相伴隨的,裸鼠、Rag-/-小鼠等適應(yīng)性免疫缺陷鼠被廣泛應(yīng)用,但至今尚無(wú)研究系統(tǒng)探討RSV在免疫缺陷小鼠中的病理特征及致病機(jī)制。裸鼠是一種T細(xì)胞缺陷但固有免疫正常的小鼠品系,本研究擬建立RSV感染裸鼠模型,在裸鼠中排除T細(xì)胞干擾的情況下,觀察RSV的復(fù)制情況及病理特征(包括氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺組織病理?yè)p傷及氣道高反應(yīng)性(Airway Hyperresponsiveness, AHR)),為進(jìn)一步探討固有免疫在RSV致病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：6-8周雌性T細(xì)胞缺陷裸鼠(BALB/c背景)及野生型正常BALB/c小鼠分為對(duì)照組及RSV組,分別滴鼻接種細(xì)胞培養(yǎng)上清或RSVA2病毒液,于感染后第1-7天,第9天、12天及14天收集全肺組織,空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度；于第1天、3天、5天、7天、14天、21天、30天及60天灌取支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalvo larlavage fluid,BALF)并行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)；部分小鼠取左肺,HE染色后行組織病理評(píng)分；肺功能檢測(cè)采用全身體積描技法；BALF中細(xì)胞因子的測(cè)定采用ELISA法。結(jié)果：(1)裸鼠及BALB/c小鼠肺組織中RSV復(fù)制高峰在第3天,感染后4天內(nèi),裸鼠中病毒滴度低于BALB/c小鼠,但在第9天及第12天,裸鼠中仍能檢測(cè)出病毒復(fù)制,而B(niǎo)ALB/c小鼠中則不能；(2)RSV在裸鼠及BALB/c小鼠中均引起明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺組織病理?yè)p傷及AHR,這些異常改變?cè)诘?天既已出現(xiàn),于第5-7天達(dá)高峰,之后逐漸降低,但直至第60天仍未完全恢復(fù)正常；(3)RSV在裸鼠及BALB/c小鼠中引起細(xì)胞因子發(fā)生雙相變化,感染后第1天,Ⅰ型干擾素在兩種小鼠中明顯升高,以裸鼠中升高更為顯著,之后恢復(fù)正常；第5-7天,BALB/c小鼠中IFN-y顯著升高,至第14天恢復(fù)正常,但在裸鼠中IFN-y始終處于基線水平；感染后期,尤其是在第21天及第30天,Th2類細(xì)胞因子及Thl7類細(xì)胞因子在兩種小鼠中均顯著升高。結(jié)論：(1)裸鼠中病毒清除延遲,提示固有免疫雖能控制感染早期RSV復(fù)制水平,但病毒的有效清除依賴于T細(xì)胞；(2)固有免疫可不依賴于T細(xì)胞,獨(dú)立介導(dǎo)RSV相關(guān)急慢性期氣道炎癥及AHR；(3)RSV感染裸鼠及BALB/c小鼠后,引起細(xì)胞因子發(fā)生雙相變化,但細(xì)胞因子譜有所不同,提示不同時(shí)期、不同免疫背景小鼠中RSV的致病機(jī)制存在差異。第二部分 MMP-12不依賴于IFN-γ介導(dǎo)裸鼠RSV感染后急性期氣道炎癥及AHR目的：課題組前期研究已證實(shí)RSV感染BALB/c小鼠第5天,IFN-γ顯著升高,并介導(dǎo)了急性期氣道炎癥及AHR,但尚未明確IFN-γ的主要來(lái)源。本研究第一部分結(jié)果顯示RSV感染裸鼠后,雖引起明顯的氣道炎癥及AHR,但I(xiàn)FN-γ無(wú)明顯變化,提示存在IFN-γ非依賴的致病機(jī)制。因此,本部分在此基礎(chǔ)上,擬進(jìn)一步闡明RSV誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ的主要來(lái)源,并深入探討IFN-γ非依賴的致病機(jī)制。方法：6-8周雌性裸鼠及BALB/c小鼠滴鼻接種RSV后第1天、3天、5天、7天及第9天檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)并收集標(biāo)本。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中T細(xì)胞及NK細(xì)胞,并標(biāo)記胞內(nèi)IFN-γ。采用兔抗鼠asialo GM1抗體去除NK細(xì)胞。采用ELISA法測(cè)定BALF中細(xì)胞因子。用MMP408灌胃特異性阻斷MMP-12,抗小鼠IFN-γ單抗及外源性重組小鼠IFN-γ因子則經(jīng)腹腔注射給藥。白藜蘆醇腹腔注射后滴鼻給予含SARM siRNA或陰性對(duì)照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑,Western Blot檢測(cè)肺組織中SARM、 TRIF的表達(dá)。肺功能檢測(cè)采用全身體積描記法。結(jié)果：(1)RSV感染后,裸鼠中IFN-γ始終處于基線水平;BALB/c小鼠中IFN-γ、CD3+CD4+IFN-γ+Thl細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+Tc1細(xì)胞于感染后第5天均明顯增多；BALB/c小鼠中去除NK細(xì)胞后IFN-γ無(wú)明顯變化；(2)RSV感染裸鼠后第3-9天,MMP-12明顯升高；BALB/c小鼠中MMP-12第7天開(kāi)始升高,第9天時(shí)顯著高于對(duì)照組；用MMP408特異性抑制MMP-12后,兩種小鼠中氣道炎癥及AHR明顯緩解；(3)RSV感染第5天,用重組小鼠IFN-γ因子處理裸鼠后,IFN-γ升高,MMP-12顯著降低;用抗小鼠IFN-γ單抗處理BALB/c小鼠后,IFN-γ降低,MMP-12顯著升高；(4)RSV感染裸鼠第5天,SARM表達(dá)降低,TRIF明顯升高；白藜蘆醇處理后,SARM恢復(fù)正常,TRIF及MMP-12降低,氣道炎癥及AHR減輕；白藜蘆醇處理后轉(zhuǎn)染SARM siRNA, SARM被有效沉默,TRIF、MMP-12再次顯著升高,白藜蘆醇的抗RSV作用被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：(1)RSV誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ主要來(lái)自T細(xì)胞；(2)MMP-12可不依賴于IFN-γ,介導(dǎo)部分RSV相關(guān)急性氣道炎癥及AHR;(3)IFN-γ可抑制MMP-12產(chǎn)生；(4)裸鼠中,RSV引起MMP-12升高受SARM-TRIF信號(hào)通路調(diào)控。研究結(jié)果率先證明SARM-TRIF對(duì)MMP-12的調(diào)控作用,進(jìn)一步揭示了TLRs網(wǎng)絡(luò)與肺部基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系,尤其強(qiáng)調(diào)了SARM-TRIF-MMP-12可作為防治RSV感染的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。第三部分 NK細(xì)胞分泌Th2類及Th17類細(xì)胞因子介導(dǎo)裸鼠RSV感染后期慢性氣道炎癥及AHR目的：RSV可引起長(zhǎng)期持續(xù)的氣道炎癥及AHR,且與反復(fù)喘息和哮喘的發(fā)生密切相關(guān),但具體機(jī)制不清。本研究第一部分結(jié)果顯示RSV感染裸鼠及BALB/c小鼠后,氣道炎癥及AHR可持續(xù)至少60天,感染后期,Th2類及Th17類細(xì)胞因子顯著升高。既往認(rèn)為這類細(xì)胞因子主要來(lái)自T細(xì)胞,裸鼠缺乏T細(xì)胞,肺部NK細(xì)胞含量較多,NK細(xì)胞是固有免疫的關(guān)鍵成分之一,其在RSV感染急性期及哮喘中的作用均已得到證實(shí),但NK細(xì)胞是否參與RSV感染后期的致病尚未見(jiàn)報(bào)道。本部分?jǐn)M進(jìn)一步探討NK細(xì)胞能否通過(guò)分泌Th2類及Th17類細(xì)胞因子促進(jìn)RSV相關(guān)慢性氣道炎癥及AHR的形成或維持。方法：6-8周雌性裸鼠及BALB/c小鼠接種RSV后第7天、14天、21天、30天及第60天檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)并收集標(biāo)本。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中T細(xì)胞及NK細(xì)胞。采用兔抗鼠asialo GM1抗體去除NK細(xì)胞,用抗小鼠CD8a單抗去除CD8+T細(xì)胞,上述抗體及白藜蘆醇經(jīng)腹腔注射給藥,全身體積描記法檢測(cè)肺功能,ELISA檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子,Q-PCR法檢測(cè)TLRs mRNA水平,Western Blot檢測(cè)肺組織中TRIF蛋白表達(dá)。結(jié)果：RSV感染后期：(1)裸鼠肺組織中T細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到,NK細(xì)胞顯著增多,去除NK細(xì)胞或白藜蘆醇處理減少NK細(xì)胞后,Th2類及Th17類細(xì)胞因子顯著降低,氣道炎癥及AHR明顯緩解；(2)BALB/c小鼠中NK細(xì)胞及T細(xì)胞均顯著增多,去除NK細(xì)胞后,T細(xì)胞未受影響,Th2類及Th17類細(xì)胞因子降低,氣道炎癥及AHR明顯緩解；白藜蘆醇處理后,NK細(xì)胞及T細(xì)胞均減少,且Th2類及Th17類細(xì)胞因子降低的幅度、氣道炎癥及AHR緩解的程度較單純?nèi)コ齆K細(xì)胞明顯；(3) BALB/c小鼠中去除CD8+T細(xì)胞后,NK細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞顯著增多,Th2類及Th17類細(xì)胞因子進(jìn)一步升高,氣道炎癥及AHR加重；(4)兩種小鼠中多種TLRs及TRIF表達(dá)升高,白藜蘆醇處理后,TRIF表達(dá)被顯著抑制。結(jié)論：(1)NK細(xì)胞可分泌Th2類及Th17類細(xì)胞因子,介導(dǎo)RSV相關(guān)慢性氣道炎癥及AHR；裸鼠中,NK細(xì)胞是Th2類及Th17類細(xì)胞因子的主要來(lái)源,而B(niǎo)ALB/c小鼠中,NK細(xì)胞可不依賴于T細(xì)胞或與T細(xì)胞協(xié)同促進(jìn)Th2類及Th17類細(xì)胞因子升高；(2)RSV感染后期,CD8+T細(xì)胞通過(guò)抑制NK細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用；(3)RSV感染后期,NK細(xì)胞、T細(xì)胞的募集和(或)活化與TRIF信號(hào)通路有關(guān)。研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)病毒感染后反復(fù)喘息和哮喘的發(fā)生機(jī)制、尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)提供了重要理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：
２．２小鼠肺組織中ＲＳＶ滴度測(cè)定??２．２．１?ＲＳＶ引起的合胞病變??如圖１．２所示，民ＳＶ組小鼠肺組織勻漿接種Ｈｅｐ－２細(xì)胞后產(chǎn)生明顯的合胞病??變，細(xì)胞融合成片，可見(jiàn)拉絲，結(jié)果提示ＲＳＶ接種成功。??■ｍ??圖１．２小魚(yú)肺勻漿接種Ｈｅｐ－２細(xì)胞后細(xì)胞病變效應(yīng)化ＰＥ）??Ａ：對(duì)照組Ｂ：?ＲＳＶ惠染組??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ?ｅｆｆｅｃｔ?（ＣＰＥ）?ｏｆ?Ｈｅｐ－２?ｃｅｌｌｓ?ａｆｔｅｒ?ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｍｉｃｅ?ｌｕｎｇ??ｔｉｓｓｕｅ?ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ??Ａ；?Ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?Ｂ：?ＲＳＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｍｉｃｅ?ｇｒｏｕｐ??３０??
ｗｉｔｈ?ＢＡＬＢ／ｃ?ｍｉｃｅ．??２丄２小鼠肺組織Ｔ細(xì)胞及ＮＫ細(xì)胞計(jì)數(shù)??如圖３．２所示．民ＳＶ感染裸鼠后第２１天（ＰＣＯ．Ｏｌ）及第３０天（ＰＣＯ．ＯＯｎ，??肺組織中ＮＫ細(xì)胞（ｂ）顯著高于其對(duì)照組：民ＳＶ感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后第２１天及??第３０天，肺組織中Ｔ細(xì)胞（ａ）及ＮＫ細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組。裸鼠肺組織中Ｔ??細(xì)胞顯著低于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（Ｐ＜０．００１），而ＮＫ細(xì)胞顯著高于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠ＣＰ??＜０．０１）。??３〇－｜?？目ＡＬＢ／Ｃ?ｍｉｃｅ?－＊？目ＡＬＢ化?ｍｉｃｅ??各?？．?Ｎｕ舶?ｍｉｃｅ?３０奪?Ｎｕｄｅ?ｍｉｃｅ??弓?２０－?Ｖ??Ｓ１０－?／?＊?蘭?２０－?／、、、??芒１?＾?多?／??３?：１?ｒ－＂－東二聾一??ｃｏｎｔｒｏｌ?２１?３０?Ｊ?＂?■??ａ）?Ｄａｙｓ?ａｆｔｅｒ?ＲＳＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?°?ｃｏｎｔｒｏｌ?２＾?Ｔｏ￣??Ｄａｙｓ?ａ行ｅｒ?ＲＳＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??７７??
?獻(xiàn)醫(yī)科大削壬研觸學(xué)位論文???ｎ＝８，?Ａｐ＜〇．〇５，?ＡＡｐｃＯ．ｏｉ，?ＡＡＡｐ＜〇?Ｑ〇ｉ，?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｎｕｄｅ?ｍｉｃｅ、ｖｉｔｈ?０化ｅｒ?ｇｒｏｕｐｓ；??ｂ＾Ｐ＜０．０５，?ｂ＾＾Ｐ＜０．０Ｉ，?ｂ＾＾＾Ｐ＜０．００１，?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ＲＳＶ＋ＲＥＳ?ｗｉｔｈ?ＲＳＶ?－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｎｕｄｅ?ｍｉｃｅ．??＊Ｐ＜０．０５，?＊＊Ｐ＜０．０１，?＊＊＊Ｐ＜０．００１?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＢＡＬＢ／ｃ?ｍｉｃｅ?ｗｉｔｈ?ｏｔｈｅｒ?ｇｒｏｕｐｓ；?ａ＊Ｐ＜０．０５，??ａ＊＊Ｐ＜０．０１，?ａ＊＊＊Ｐ＜０．００１?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ＲＳＶ＋ＲＥＳ?ｇｒｏｕｐ?ｗｉｔｈ?ＲＳＶ?－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＢＡＬＢ／ｃ?ｍｉｃｅ．??２．４．６白巧蘆醇對(duì)ＲＳＶ感染后期ＴＲＩＦ表達(dá)的影響??如圖３．２０所示，ＲＳＶ組裸鼠（ａ）肺組織中ＴＲＩＦ蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組（Ｐ??＜０．０５）及民ＳＶ＋ＲＥＳ?組（Ｐ＜０．０５）。ＲＳＶ?姐?ＢＡＬＢ／ｃ?小鼠（ｂ）肺組織中?ＴＲＩＰ??蛋白表達(dá)也豆著高于其對(duì)照組（Ｐ＜０．０１）及民ＳＶ＋ＲＥＳ組（Ｐ＜Ａ０１）。??
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本文編號(hào)：
2893046
