發(fā)布時間：2020-11-21 03:17

　　 目的： 早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷(white matter damage, WMD)被認為是早產(chǎn)兒最主要也是最重要的腦損傷。WMD的關鍵性靶細胞是少突膠質(zhì)前體細胞。最近有學說指出WMD的發(fā)病機制中存在少突膠質(zhì)前體細胞分化障礙。流行病學和動物實驗研究均表明宮內(nèi)感染是早產(chǎn)兒WMD發(fā)生的主要因素之一。神經(jīng)免疫應答反應被認為在宮內(nèi)感染和早產(chǎn)兒WMD中起重要的介導作用。但具體的分子機制目前還不明確。 Toll樣蛋白的研究是近年來炎癥信號傳導領域取得的最重要進展。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)激活后通過誘導一系列炎性相關因子的表達調(diào)控機體固有性免疫應答,并最終激活適應性免疫應答。研究指出TLR-4信號通路參與缺血性腦梗塞、腦挫傷、帕金森氏病、蛛網(wǎng)膜下腔出血、多發(fā)性硬化、缺氧性腦損傷等一系列免疫應答相關性腦損傷的發(fā)生。因此有學者提出：神經(jīng)免疫應答過程中小膠質(zhì)細胞TLR-4信號的表達啟動在腦內(nèi)防御反應及腦損傷的平衡機制中起重要作用。最新的研究還指出TLR-4信號能直接激活經(jīng)典的notch1信號通路分子。而Notch1信號通路通過其下游目的基因Hes (Hairy enhancer of split)基因家族(如Hes1、Hes5等)對少突膠質(zhì)細胞分化起到重要的負性調(diào)控作用。 目前國內(nèi)外對于TLR-4信號在宮內(nèi)感染致WMD發(fā)生中作用的研究不多,且多集中在離體水平上。過去幾年間,我們實驗室通過子宮頸內(nèi)接種大腸桿菌的方式成功建立了宮內(nèi)感染致新生大鼠WMD的動物模型。基于這一成熟模型,本研究觀察宮內(nèi)感染后仔鼠腦內(nèi)TLR-4信號分子表達。并通過檢測相關下游細胞因子、少突膠質(zhì)細胞分化負性調(diào)控因子,進一步探討TLR-4信號在宮內(nèi)感染致WMD中的作用機制。該研究為臨床治療早產(chǎn)兒WMD提供豐富的動物實驗信息及依據(jù),為今后相關領域深入研究奠定整體動物實驗基礎,并為進一步研究早產(chǎn)兒WMD的防治提供新的靶點。 方法： 1.實驗分組：將孕鼠隨機分為對照組、宮內(nèi)感染組。宮內(nèi)感染組孕齡15天的孕鼠宮頸左右兩側各注射大腸桿菌稀釋液0.2 ml,對照組同孕齡孕鼠注入等量生理鹽水。 2.標本采集：選擇17、19、21天胎齡和新生1、3、7、14日齡為觀察時點,剖腹取出胎鼠或者隨機選取各組新生仔鼠斷頭處死,取出腦組織置于10%中性甲醛或液氮速凍后-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。 3.實驗方法：測定各時點仔鼠體重、腦重。應用蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色觀察各組新生1、3、7、14日齡大鼠腦室周圍白質(zhì)組織病理變化特點。Western blot檢測各時點仔鼠腦組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、TLR-4和核因子kappa B p65 (nuclear factor-kappa B p65, NF-κB p65)的蛋白表達水平,熒光定量RT-PCR檢測各時點仔鼠腦內(nèi)TLR-4、NF-κB p65、細胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α.白細胞介素(interieukin, IL)-1β、Notch1、Hes5 mRNA的表達。 結果： 1.44只孕鼠活動、進食均正常,無1例發(fā)生死亡、早產(chǎn)。仔鼠情況：對照組獲取新生仔鼠66只,17、19、21天胎齡仔鼠56、55、58只,死產(chǎn)2只,死胎7只；宮內(nèi)感染組獲取新生仔鼠70只,17天、19天、21天胎齡仔鼠57、58、56只,死產(chǎn)5只,死胎8只。 宮內(nèi)大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤內(nèi)血管充血、水腫,并見大量中性粒細胞浸潤。對照組的孕鼠子宮及病理檢測均未見明顯的炎癥反應。 2.宮內(nèi)感染后,各時點胎鼠及1日齡仔鼠體重、腦重下降. 3.7、14日齡仔鼠腦室周圍白質(zhì)部位HE染色可見：對照組腦白質(zhì)組織結構正常,染色清晰；宮內(nèi)感染組腦白質(zhì)染色淡,結構稀疏呈篩網(wǎng)狀改變。 4.對照組14日齡仔鼠腦組織出現(xiàn)MBP表達,宮內(nèi)感染組14日齡仔鼠腦組織MBP表達減少甚至消失。 5.宮內(nèi)感染后TLR-4及其下游信號分子NF-κB p65表達在17日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內(nèi)同步化上調(diào)。 6.宮內(nèi)感染后19、21天胎齡仔鼠腦內(nèi)TNF-α表達上調(diào)。 7.宮內(nèi)感染后Notchl及其下游信號分子Hes5表達在19日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內(nèi)同步化上調(diào)。 結論： 1.宮內(nèi)感染可使胎鼠體重、腦重下降。 2.TLR-4信號可能參與宮內(nèi)感染致WMD的發(fā)生。 3.TLR-4信號可能通過調(diào)控細胞因子的的表達部分介導宮內(nèi)感染后WMD的發(fā)生。 4.TLR-4信號在宮內(nèi)感染致腦白質(zhì)病變的發(fā)生中的作用可能部分源于激活的Notchl信號阻礙少突膠質(zhì)細胞前體分化。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R722.1
【部分圖文】：

圖1.6宮內(nèi)感染組和對照組新生鼠腦內(nèi)TLR一4mRNA表達水平比較**表示兩組比較，尸<0.01，*表示兩組比較，尸<0.05。P1P3P，E君。醒i心俱飛澳黝墓E龍。王呈公O幻t拍瑤ECO甄TL獲確aCtin42k今

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本文編號：2892438