發(fā)布時間：2019-07-19 14:10

【摘要】：研究背景 急性胃腸炎是影響人群公共健康的重要疾病之一。經(jīng)過去20多年的研究發(fā)現(xiàn),病毒已經(jīng)取代細菌成為引起急性胃腸炎最重要的病原體,其中最常見的是輪狀病毒和諾如病毒。 諾如病毒,又稱為諾瓦克樣病毒,是第一個被確認的能夠引起急性胃腸炎的病毒。它可以感染任何年齡段的人群,而且由于其具有能夠在宿主體外長時間穩(wěn)定存活、引起感染只需要很低的病毒載量、感染后缺乏長期免疫以及基因組常發(fā)生變異、重組等特點,導致諾如病毒感染極易在散發(fā)基礎上出現(xiàn)暴發(fā)流行,因此也被稱為“胃腸流感”。雖然我國早在1995年就有了諾如病毒感染的病例報道,但由于缺乏快速、敏感的檢測方法,而且未將諾如病毒感染列入醫(yī)院常規(guī)檢測項目,致使諾如病毒感染的分子流行病學特征和臨床表現(xiàn)的相關資料不足,嚴重阻礙了諾如病毒感染的防治進展。 輪狀病毒被認為是引起兒童急性胃腸炎最重要的病原體,尤其是5歲以下年齡的兒童,在這一年齡段至少會經(jīng)歷過一次輪狀病毒的感染。美國國家疾病預防與控制中心的報告指出,每年輪狀病毒感染在全球范圍內(nèi)可以引起2500萬患兒就診,200萬患兒住院治療,將近60萬患兒死亡,因此輪狀病毒感染受到各國和地區(qū)的重視。但在臨床治療中發(fā)現(xiàn)并沒有針對輪狀感染的特效藥物,從而將對輪狀病毒感染的控制寄希望于高效價疫苗的研制與應用。諾如病毒是僅次于輪狀病毒引起5歲以下兒童急性胃腸炎的常見病原體,雖然每年至多會引起20萬患兒死亡而且引起的臨床癥狀較輕,但由于一直沒有研制出疫苗用來進行預防,因此諾如病毒的感染亦不容忽視。如果能在臨床診斷與治療中將二者感染進行鑒別,將會有效避免感染的大范圍傳播與流行。 本研究主要分為兩個部分：第一部分主要研究濟南地區(qū)成人諾如病毒感染的分子流行病學特征與臨床特征；第二部分主要研究濟南地區(qū)5歲以下兒童輪狀病毒與諾如病毒感染的分子流行病學特征以及二者感染特征的比較。旨在提供真實可靠的諾如病毒與輪狀病毒感染的流行病學特征和臨床表現(xiàn)資料,為疫苗的研制提供科學的依據(jù),為疾病的防治提供幫助。 第一部分 濟南成人急性胃腸炎患者諾如病毒感染的臨床與分子流行病學特征研究 目的： 1.研究濟南地區(qū)成人急性胃腸炎患者中諾如病毒的感染情況、流行特征及臨床表現(xiàn)。 2.研究濟南地區(qū)成人諾如病毒感染患者中是否存在重組諾如病毒株。 方法： 1.自2010年6月至2011年5月,在山東大學齊魯醫(yī)院感染病科胃腸道門診收集480例成人急性胃腸炎患者的臨床資料及糞便標本。標本采集后立即混懸離心,提取上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。 2.提取每例糞便標本中的病毒RNA,提取后立即用經(jīng)滅活RNA酶處理的超純水進行稀釋,分裝后保存于-700C待用。 3.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法對提取的病毒RNA進行擴增。為檢測是否存在變異重組諾如病毒株,每例病毒RNA標本均采用兩種針對基因組不同編碼序列區(qū)段的引物進行擴增。 4.對擴增出來的核酸物質(zhì)進行純化,然后測定其序列。所有核酸序列應用BLAST程序同NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中保存的諾如病毒株序列進行比對,然后采用Clustal X與MEGA程序進行多序列比對和構建進化樹,進行流行基因型的分析。 5.對具有變異重組可能的病毒株RNA進行跨區(qū)域核酸序列擴增,擴增后提純并測序,然后應用Simplot軟件進行重組分析。 結果： 1.在收集到的480例糞便標本中,42例被檢測出諾如病毒陽性,陽性率為8.75%。 2.檢測到的諾如病毒株主要有7個基因型,GⅠ-1,GⅠ-4,GⅡ-1,GⅡ-3,GⅡ-4,GⅡ-6和GⅡ-13。其中最為流行的優(yōu)勢基因型為GⅡ-4(29/42,69.0%)。 3.諾如病毒感染患者的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉(97.6%)、腹痛(40.5%)、發(fā)熱(28.6%)和嘔吐(16.7%)。腹瀉與嘔吐的頻次分別為6.08(±1.42)次/天和2.61(±1.37)次/天。 4.諾如病毒感染全年均可見到,高峰期出現(xiàn)在9月至12月,低谷期出現(xiàn)在6月至7月。 5.在42株諾如病毒中,發(fā)現(xiàn)3株重組型病毒,分別為2株GⅡ-4聚合酶/GⅡ-3衣殼重組株和1株GⅡ-6聚合酶/GⅡ-4衣殼重組株。 結論： 諾如病毒已經(jīng)成為濟南地區(qū)導致成人急性胃腸炎常見的病原體。感染常年可見,高峰期主要出現(xiàn)在9月至12月,引起的常見臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、發(fā)熱和嘔吐。流行的諾如病毒基因呈多樣性,GⅡ-4為流行優(yōu)勢基因型,與全球的流行趨勢相吻合。諾如病毒基因組易發(fā)生重組,在本研究中也出現(xiàn)了3株重組病毒株,其中GⅡ-6聚合酶/GⅡ-4衣殼重組株在中國還是第一次發(fā)現(xiàn),應該給予重視并進行持續(xù)性觀察,避免引起大范圍的暴發(fā)流行。 第二部分濟南地區(qū)兒童輪狀病毒與諾如病毒感染的臨床與分子流行病學特征及兩者特征比較的研究 目的： 1.研究濟南地區(qū)5歲以下兒童急性胃腸炎患者中輪狀病毒感染情況、流行特征及臨床表現(xiàn)。 2.研究濟南地區(qū)5歲以下兒童急性胃腸炎患者中諾如病毒感染情況、流行特征及臨床表現(xiàn)。 3.研究濟南地區(qū)5歲以下兒童諾如病毒感染與輪狀病毒感染特征的比較。 方法： 1.自2011年2月至2012年1月在山東大學齊魯醫(yī)院兒科與山東大學齊魯兒童醫(yī)院收集767例5歲以下急性胃腸炎患兒的臨床資料與糞便標本。其中門診患者502例,住院患者265例。標本采集后立即混懸離心,提取上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。 2.提取每例糞便標本中的病毒RNA,提取后立即用經(jīng)滅活RNA酶處理的超純水進行稀釋,分裝后保存于-70℃待用。 3.采用ELISA的方法對每例糞便標本進行輪狀病毒的初步篩查,對陽性標本的病毒RNA采用針對不同基因型和血清型的引物進行RT-PCR擴增。為避免ELISA假陰性結果的出現(xiàn),從陰性標本中隨機抽取252例(50%)同時進行擴增。 4.擴增獲得的輪狀病毒核酸序列進行瓊脂糖凝膠電泳,然后經(jīng)溴化乙錠染色在紫外線下觀察,鑒定不同基因型和血清型。 5.采用不同基因組型諾如病毒擴增引物對所有糞便標本提取的病毒RNA進行核酸序列的擴增,然后提純并進行測序。所有核酸序列應用BLAST程序同NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中保存的諾如病毒株序列進行比對,然后采用Clustal X與MEGA程序構建進化樹,進行流行基因型的分析。 6.對收集到的患兒臨床資料進行統(tǒng)計學分析,所有均數(shù)以±SD表示,組間比較采用卡方檢驗和U檢驗的方法,P0.05代表具有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.在收集到的767例糞便標本中,263例檢測出輪狀病毒陽性,陽性率為34.3%；80例檢測出諾如病毒陽性,陽性率為10.4%。其中混合感染為8例。 2.263例輪狀病毒株中,檢測出5種血清型和3種基因型,其中最常見的血清型和基因型分別為G3(40.7%)和P[8](46.8%)。 3.80例諾如病毒株全部來自于GⅡ基因組,分別為GⅡ-3,GⅡ-4和GⅡ6。最為流行的基因型為GⅡ-4(61.2%),分別屬于GⅡ-42004-2006和GⅡ-42006b兩個亞型。 4.輪狀病毒感染患者與諾如病毒感染患者平均年齡分別為24.2(±14.0)個月和19.9(±15.8)個月。通過U檢驗兩者之間的差別具有統(tǒng)計學意義。 5.輪狀病毒感染的高峰期出現(xiàn)在11月至次年的1月,諾如病毒感染的高峰期出現(xiàn)在9月至11月。 6.輪狀病毒和諾如病毒感染患兒的主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和發(fā)熱。輪狀病毒感染患兒的腹瀉與嘔吐平均頻次分別為5.08(±1.85)次/天和2.61(±1.35)次／天,體溫升高平均程度為38.0(4±0.65)。C；諾如病毒感染患兒的腹瀉與嘔吐平均頻次分別為4.99(±±1.55)次/天和2.20(±1.47)次/天,體溫升高平均程度為37.8(±0.62)。C。通過U檢驗發(fā)現(xiàn)腹瀉頻率、嘔吐頻率和發(fā)熱程度之間的差異均不具有統(tǒng)計學的意義(P0.05)。 結論： 輪狀病毒與諾如病毒是濟南地區(qū)引起5歲以下兒童急性胃腸炎的常見病原體,最為流行的基因型分別為G3P[8]和GⅡ-4。輪狀病毒發(fā)病率明顯要高于諾如病毒的發(fā)病率,而且在臨床癥狀上表現(xiàn)的更為嚴重。感染常見于2歲以內(nèi)的患兒,諾如病毒感染的患兒較輪狀病毒感染的患兒要小幾個月。最常見的癥狀是腹瀉、嘔吐和發(fā)熱。感染在一年中均可見,但高峰期主要出現(xiàn)在秋冬季節(jié),而且諾如病毒感染的高峰期比輪狀病毒來的稍早。本研究展示了真實可靠的5歲以下兒童輪狀病毒與諾如病毒感染的流行病學和臨床表現(xiàn)特征,為病毒感染的預防、控制與治療提供科學的依據(jù)。
【圖文】：

圖1. 2010年6月至2011年5月濟南地區(qū)單月諾如病毒感染陽性率統(tǒng)計圖2010年10月諾如病毒檢出率最高，為15.3%; 2010年6月最低，為4.1%。各月感染率分別為：4.1%，，4.5%, 6.0%, 13.3%, 15.3%, 14.3%，12.0%，7.5%,8.7%, 9.4%，8.6%, 6.1%。Fig.l Monthly distribution of norovirus infections between June 2010 and May2011 in Ji'nan.The highest detection rate (15.3%) was shown in October, 2010. The lowest

圖2. 2011年2月至2012年1月濟南地區(qū)單月輪狀病毒與諾如病毒感染率統(tǒng)計圖輪狀病毒感染的高峰期從11月開始，持續(xù)到次年的1月；諾如病毒感染的高峰期從9月開始，到11月結束。輪狀病毒每月感染率分別為：29.8%; 28.8%;25.9%; 27.9%; 27.4%; 23.4%; 24.3%; 32.8%; 30.1%; 62.2%; 51.3%; 37.9%；諾如病毒每月感染率分別為 8.5%; 11.5%; 13.0%; 7.4%; 6.5%; 6.3%; 8.6%; 13.4%; 17.2%;13.5%; 8.9%; 8.2%。Figure 2: Monthly distribution of rotavirus and norovirus infections betweenFebruary 2011 and January 2012 in Ji'nan.Rates of rotavirus infection: 29.8%; 28.8%; 25.9%; 27.9%; 27.4%; 23.4%;24.3%; 32.8%; 30.1%; 62.2%; 51.3%; 37.9%. Rates of norovirus infection; 8.5%;11.5%; 13.0%; 7.4%; 6.5%; 6.3%; 8.6%; 13.4%; 17.2%; 13.5%; 8.9%; 8.2%
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.5;R725.1

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本文編號：2516358