【摘要】：在我國,慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)的發(fā)病率逐年升高。CKD主要表現(xiàn)為尿蛋白排泄增加,腎功能進(jìn)行性減退,最終發(fā)展為終末期腎衰竭,足細(xì)胞在此過程中起著重要作用。足細(xì)胞(Podocyte)在胚胎發(fā)育時(shí)起源于間充質(zhì)細(xì)胞,發(fā)育成熟后是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分,足細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)類似,且都是終末分化細(xì)胞,增殖能力非常有限。足細(xì)胞通過α3β1整合素粘附在基底膜而保持其結(jié)構(gòu)和功能完整性,當(dāng)足細(xì)胞發(fā)生表型改變,α3β1整合素減少時(shí),足細(xì)胞粘附力下降引發(fā)足細(xì)胞脫落。足細(xì)胞不可逆的損傷和丟失是導(dǎo)致大量蛋白尿和腎小球硬化的重要病理基礎(chǔ)。但目前尚沒有對針對足細(xì)胞損傷和丟失切實(shí)有效的治療方法。近年來我們課題組在線粒體功能障礙(Mitochondria dysfunction, MtD)與足細(xì)胞損傷中的作用開展了大量的前期研究,發(fā)現(xiàn)MtD是足細(xì)胞損傷的早期事件,可直接介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。由此,我們推測,線粒體功能可能是慢性腎臟病足細(xì)胞損傷和丟失的干預(yù)靶點(diǎn)。PGC-1家族(Peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1 family)包括PGC-1α, PGC-1β和PRC (PGC-1 related coactivator)三個(gè)成員,其在能量代謝和線粒體合成中起著重要作用。PGC-1α為轉(zhuǎn)錄共激活因子,主要表達(dá)于能量需求高或富含線粒體的組織中,如心臟、腎、骨骼肌等。其具有多種重要的生理學(xué)功能,如調(diào)節(jié)線粒體生物合成、葡萄糖代謝、肌纖維類型的轉(zhuǎn)化、脂肪酸氧化等。PGC-1α通過以下兩個(gè)方面調(diào)控整個(gè)細(xì)胞代謝和線粒體功能：1、增加線粒體生物合成引起細(xì)胞重構(gòu),2、改變線粒體功能重構(gòu)細(xì)胞器。PGC-1α一方面增加氧化代謝,線粒體產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS),一方面增強(qiáng)抗氧化酶表達(dá),如過氧化物還原酶3 (Peroxiredoxin 3, PRX3)、過氧化氫酶還原酶5(Peroxiredoxin 5, PRX5)、MnSOD、線粒體型硫氧還蛋白還原酶以及過氧化氫酶等,迅速降低胞內(nèi)ROS水平。PGC-1α可以與核呼吸因子(Nuclearrespiratory factor,NRF)相互作用,促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)表達(dá),促進(jìn)線粒體DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)。mtDNA和核基因組共同編碼氧化磷酸化途徑相關(guān)的呼吸鏈酶,PGC-1α通過與NRF的作用促進(jìn)三磷酸腺苷(Adenosine-5'-triphosphate, ATP)產(chǎn)生增加。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中,PGC-1α可以通過阻斷線粒體功能障礙減少足細(xì)胞損傷,但PGC-1α在體內(nèi)足細(xì)胞中的作用尚不清楚,本研究通過腎小球足細(xì)胞條件性PGC-1α基因敲除及轉(zhuǎn)基因小鼠,闡明PGC-1α在體內(nèi)足細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制。第一部分PGC-la在慢性腎臟病患兒腎活檢組織中的表達(dá)目的：觀察PGC-1α、WT-1、a3-integrin在慢性腎臟病患兒(FSGS.MCD)腎組織中的表達(dá)水平。分析PGC-1α與足細(xì)胞表型改變、足細(xì)胞數(shù)目減少是否具有相關(guān)性。方法：慢性腎臟病患兒共20例,男12例,女8例,平均年齡5歲9個(gè)月。局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)和微小病變(MCD)各10例。正常對照組腎臟組織來源于腎臟腫瘤切除術(shù)后腫瘤周邊腎組織,共6例。應(yīng)用免疫組化檢測活檢腎組織中PGC-1α的表達(dá),免疫熒光觀察WT-1和a3-integrin表達(dá)。分析PGC-1α與WT-1和a3-integrin表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：對照組免疫組化染色結(jié)果顯示腎臟組織都可見PGC-1α表達(dá),但在小管中近段腎小管表達(dá)最多,遠(yuǎn)端小管、集合管表達(dá)相對較少,在腎小球中足細(xì)胞和系膜細(xì)胞表達(dá)較多,CKD患兒的活檢腎組織PGC-1α表達(dá)量較對照組明顯減少,FSGS組較對照組減少近90%,MCD組減少50%。WT-1和a3-integrin在CKD患兒活檢腎組織中也明顯減少,FSGS患兒減少比MCD患兒減少更顯著。半定量分析顯示PGC-la減少與a3-integrin、WT-1減少呈正相關(guān)。結(jié)論：PGC-1α在FSGS及MCD患兒中表達(dá)減少,且FSGS減少較MCD減少更為顯著。PGC-1α在慢性腎臟病中減少與a3-integrin、WT-1減少有正相關(guān)性。第二部分足細(xì)胞條件性PGC-1α基因敲除加重醛固酮誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和足細(xì)胞損傷目的：揭示足細(xì)胞條件性PGC-1α基因敲除對醛固酮誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和足細(xì)胞損傷的影響。方法：體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞系MPC5,應(yīng)用不同濃度的醛固酮(0,50,100,200nmol/L)或100 nmol/L醛固酮刺激不同時(shí)間點(diǎn)(0,2,4,8,12,24h)。構(gòu)建足細(xì)胞條件性PGC-1α基因敲除小鼠,進(jìn)行基因型鑒定,純合雄性PGC-1αflox/flox NPHS2cre(+)即為足細(xì)胞條件性PGC-1α基因敲除小鼠(CKO),純合雄性PGC-1α flox/flox為野生對照組(WT),通過腹腔埋置醛固酮微量滲透泵構(gòu)建慢性醛固酮腎損傷小鼠模型,收集0、7、14天24小時(shí)尿液,于第14天后處死小鼠,留取血清及腎組織。采用Western blotting和qRT-PCR檢測α3-integrin、PGC-1α、足細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Nephrin以及成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白MMP9、α-SMA和desmin的表達(dá)；細(xì)胞粘附檢測試劑盒測定足細(xì)胞粘附功能。試劑盒檢測尿白蛋白、肌酐、BUN,提取組織/細(xì)胞DNA,qRT-PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)。熒光素酶法檢測ATP含量,分離腎小球、試劑盒檢測線粒體呼吸鏈活性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),PAS染色光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變,電鏡下觀察足突改變。結(jié)果：(1)醛固酮呈劑量及時(shí)間依賴性地降低足細(xì)胞PGC-1α表達(dá),并誘導(dǎo)足細(xì)胞表型改變,上調(diào)MMP9,α-SMA和desmin而抑制P-cadherin和nephrin的表達(dá)。醛固酮亦呈劑量及時(shí)間依賴性地抑制足細(xì)胞表面粘附分子α3-integrin的表達(dá),并降低足細(xì)胞粘附能力。50μmol/L化乙錠(EtBr)誘導(dǎo)足細(xì)胞線粒體功能障礙：表現(xiàn)為線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位下降及活性氧產(chǎn)生增加,線粒體功能障礙進(jìn)一步上調(diào)MMP9,α-SMA和desmin并抑制P-cadherin和nephrin的表達(dá)。(2)醛固酮(300ng/kg/d)灌注14天后,WT小鼠24小時(shí)尿白蛋白定量達(dá)100gg/24h(約正常值4.5倍),CKO小鼠尿蛋白是WT小鼠的1.8倍；電鏡觀察WT小鼠足突發(fā)生融合,而CKD小鼠足突融合更廣泛,PAS染色顯示在WT小鼠中腎小球腫大,系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,而CKO小鼠腎小球明顯腫大,系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生更明顯；a3-integrin在WT小鼠減少50%,而CKO小鼠中減少達(dá)90%,desmin在WT小鼠中升高約2倍,CKO小鼠中升高約4倍,nephrin在WT小鼠下降約50%,在CKO小鼠減少約70%；WT-1免疫熒光后統(tǒng)計(jì)分析顯示在WT小鼠數(shù)目減少20%,而在CKO小鼠中減少達(dá)45%。分離腎小球,檢測線粒體功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)醛固酮灌注后WT小鼠mtDNA拷貝數(shù)和ATP合成降低約50%,在CKO小鼠達(dá)70%,線粒體呼吸鏈酶活性Ⅰ和Ⅳ在WT小鼠中明顯減少(70%,45%),CKO小鼠加重了活性鏈酶活性損傷(90%,70%)。結(jié)論：醛固酮抑制足細(xì)胞PGC-1α的表達(dá)并促進(jìn)表型改變,線粒體功能障礙介導(dǎo)足細(xì)胞表型變化；足細(xì)胞條件性PGC-1α基因敲除加重醛固酮誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和足細(xì)胞損傷,提示PGC-1α在維持足細(xì)胞正常功能中發(fā)揮重要作用。第三部分過表達(dá)PGC-1α通過保護(hù)線粒體功能阻斷醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷目的：明確PGC-1α過表達(dá)能否通過保護(hù)線粒體功能阻斷醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。方法：體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞系MPC5,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ad-PGC-1α腺病毒載體過表達(dá)PGC-1α后再給予醛固酮(200 nmol/L)刺激。構(gòu)建全身過表達(dá)PGC-1α轉(zhuǎn)基因小鼠,腹腔埋置微量泵構(gòu)建醛固酮慢性灌注腎損傷小鼠模型,于第14天處死小鼠,留取血清、尿及腎組織標(biāo)本。Western blotting和qRT-PCR檢測nephrin、 PGC-1α、α3-integrin的表達(dá)以及成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白MMP9、α-SMA和desmin的表達(dá),Western blotting和qRT-PCR檢測全身各組組中PGC-1α的表達(dá),熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量,通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位,試劑盒提取組織／細(xì)胞DNA,RT-PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)；試劑盒檢測24h尿白蛋白定量和肌酐、尿素氮,分離腎小球試劑盒檢測線粒體呼吸鏈活性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),PAS染色光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變,電鏡下觀察足突改變。結(jié)果：(1)轉(zhuǎn)染Ad-PGC-1α腺病毒后,PGC-1α表達(dá)升高了2倍,過表達(dá)PGC-1α阻斷醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞線粒體ROS生成增加以及ATP含量、膜電位和線粒體DNA拷貝數(shù)的下降；過表達(dá)PGC-1α逆轉(zhuǎn)Aldo誘導(dǎo)的足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變和足細(xì)胞損傷,降低Aldo誘導(dǎo)的MMP-9,α-SMA,desmin和α3-integrin以及恢復(fù)P-cadherin和nephrin的表達(dá)和細(xì)胞粘附能力。(2)轉(zhuǎn)基因小鼠中,全身各組織PGC-1α過表達(dá)不一致,PGC-1α表達(dá)在腎組織中是野生型小鼠的2倍,脾臟升高4倍,肝臟和肺升高約1.5倍。在醛固酮灌注14天后,野生型小鼠PGC-1α mRNA和蛋白水平降低40%,24h尿白蛋白升高至110μg/24h(約正常值5倍,過表達(dá)PGC-1α轉(zhuǎn)基因小鼠尿白蛋白升高僅為50μg/24h,醛固酮灌注后檢測血尿素氮,肌酐和腎小球?yàn)V過率與對照組相比沒有明顯差異；α3-integrin在野生型小鼠降低70%,nephrin減少50%,而在過表達(dá)PGC-1α轉(zhuǎn)基因小鼠可部分逆轉(zhuǎn)α3-integrin、nephrin的減少,desmin在野生型小鼠升高約2倍,轉(zhuǎn)基因小鼠升高1.2倍,WT-1免疫熒光顯示野生型小鼠足細(xì)胞數(shù)目減少40%,而轉(zhuǎn)基因小鼠足細(xì)胞數(shù)目減少20%。檢測線粒體功能發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)和ATP合成、線粒體呼吸鏈復(fù)合物(Ⅰ,Ⅲ和ⅣV)活性在野生鼠中明顯減少,而在轉(zhuǎn)基因小鼠這一現(xiàn)象被明顯抑制。電鏡觀察野生小鼠有明顯的足突融合,轉(zhuǎn)基因小鼠中足突基本正常,PAS染色顯示在野生小鼠中腎小球和系膜有明顯擴(kuò)張,而在轉(zhuǎn)基因小鼠中擴(kuò)張不明顯；結(jié)論：PGC-1α過表達(dá)可通過保護(hù)線粒體功能阻斷醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：圖１、足細(xì)胞耗盡假說
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R726.9
【相似文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前10條
1 陳洪宇;吳文斌;王永鈞;;腎臟病足細(xì)胞損傷及其防治研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2007年11期
2 王惠;何方方;張春;;足細(xì)胞損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2008年11期
3 洪亦眉;陳朝紅;;足細(xì)胞損傷的病因和發(fā)病機(jī)制[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2009年01期
4 暴小方;黃國東;;中醫(yī)藥對腎臟足細(xì)胞損傷干預(yù)作用的研究進(jìn)展[J];內(nèi)科;2013年03期
5 王慶苗;魏錦慧;;中藥防治足細(xì)胞損傷研究進(jìn)展[J];中醫(yī)研究;2014年05期
6 李芙蓉;鄭春霞;;可溶性尿激酶型纖溶酶原激活物受體與局灶節(jié)段性腎小球硬化[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2014年01期
7 李振勇;倪兆慧;;足細(xì)胞損傷的干預(yù)研究進(jìn)展[J];國際泌尿系統(tǒng)雜志;2006年04期
8 黃國東;許健;喬莉;;腎足細(xì)胞損傷中西醫(yī)治療的國內(nèi)研究進(jìn)展[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2009年12期
9 鄔民香;羅群;;糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué);2012年05期
10 肖厚勤,張建鄂,丁國華;足細(xì)胞損傷與腎小球硬化[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;2004年04期
相關(guān)會議論文 前8條
1 黃國東;許健;;腎足細(xì)胞損傷治療的國內(nèi)研究進(jìn)展[A];第10屆全國中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年
2 郭兆安;;中藥及其有效成分防治足細(xì)胞損傷研究進(jìn)展[A];第十一屆全國中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年
3 劉志紅;;足細(xì)胞損傷的研究[A];2012年浙江省腎臟病學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年
4 馮泉城;苗靜;姜麗娜;李雪娟;張曉燕;丁潔;;補(bǔ)體C3在足細(xì)胞損傷中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2012年
5 劉雙信;史偉;梁馨苓;李珩;葉智明;王文健;何朝生;梁永正;駱寧;劉艷輝;胡湘明;章斌;彭炎強(qiáng);馬健超;;RANK可能是足細(xì)胞損傷標(biāo)志[A];中華醫(yī)學(xué)會腎臟病學(xué)分會2006年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年
6 范青鋒;張涵;劉淑芳;余自華;管娜;邢燕;丁潔;;突變podocin通過TRPC6介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國兒科中青年學(xué)術(shù)交流大會論文匯編（上冊）[C];2008年
7 饒佳;徐虹;楊海春;郝偉明;;嘌呤霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中ANGPTL3對硫酸肝素蛋白多糖表達(dá)的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年
8 王文琰;張愛華;袁楊剛;朱春華;黃松明;;自噬早期激活可抑制醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[A];2012年江浙滬兒科學(xué)術(shù)年會暨浙江省醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會學(xué)術(shù)年會、兒內(nèi)科疾病診治新進(jìn)展國家級學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2012年
相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條
1 徐維瑋;糖原合成酶激酶3β調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架在足細(xì)胞損傷機(jī)制及治療中的作用[D];南京大學(xué);2014年
2 趙敏;PGC-1α調(diào)控線粒體功能阻斷慢性腎臟病足細(xì)胞損傷[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年
3 苗莉;基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)在腎臟足細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年
4 白咪;SIRT1通過線粒體自噬阻斷NLRP3炎癥小體活化和足細(xì)胞損傷[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年
5 湯曦;局灶節(jié)段性腎小球硬化足細(xì)胞損傷標(biāo)志物及凝血功能異常的研究[D];南京大學(xué);2011年
6 朱春華;線粒體功能障礙在足細(xì)胞損傷中的作用及干預(yù)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年
7 黃軼嶸;腎臟缺血再灌注中足細(xì)胞損傷機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2008年
8 陳珊;TRPC6介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流在白蛋白過負(fù)荷所致足細(xì)胞損傷中的作用[D];華中科技大學(xué);2011年
9 高丹;氯沙坦改善5/6腎切除大鼠生存率及修復(fù)足細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2012年
10 袁楊剛;線粒體功能障礙在腎小球足細(xì)胞早期損傷中作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年
相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條
1 楊向貴;miR-135能促進(jìn)wnt信號通路介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年
2 夏虹;Toll樣受體9（TLR9）在足細(xì)胞損傷中的作用[D];南京大學(xué);2014年
3 鮑文朵娜;Toll樣受體-9在足細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2016年
4 王雪;CXCL16基因沉默在減輕ox-LDL引起的足細(xì)胞損傷中的作用研究[D];山東大學(xué);2016年
5 胡夢思;粘著斑激酶在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的體外足細(xì)胞損傷中的作用研究[D];山東大學(xué);2013年
6 部璇;肝細(xì)胞生長因子保護(hù)足細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年
7 柳林芬;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對脂多糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響及可能機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年
8 姚琴;TRPC6在足細(xì)胞的表達(dá)及其與足細(xì)胞損傷修復(fù)相關(guān)性研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年
9 王惠;瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6在高糖所致足細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2011年
10 胡鶴一;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年
，
本文編號：
2512287
