發(fā)布時間：2018-02-10 16:30

  本文關(guān)鍵詞： B7-H1 共刺激分子 慢病毒 腺病毒 皮膚移植 免疫耐受 排斥反應(yīng)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 誘導(dǎo)宿主對供體特異性的免疫耐受,可以從根本上解決臨床器官移植中的免疫排斥問題。雖然應(yīng)用免疫抑制劑可以有效地抑制宿主免疫系統(tǒng)對移植物的排斥反應(yīng),但長期大劑量地使用免疫抑制劑具有明顯副作用,因?yàn)樗�在抑制免疫排斥反�?yīng)的同時,極大地削弱了患者的免疫防御功能,增加了患者發(fā)生腫瘤和機(jī)會性嚴(yán)重感染的概率。盡管人們從多方面改進(jìn)了誘導(dǎo)免疫耐受的策略,并在一些動物試驗(yàn)中取得了成功,但真正具有臨床應(yīng)用價值的可行方案并不多。通過共刺激分子抑制T細(xì)胞的活化和增殖來誘導(dǎo)免疫耐受是近年來移植免疫的研究熱點(diǎn)。 B7-H1能夠提供T細(xì)胞活化的負(fù)性共刺激信號,廣泛表達(dá)于淋巴組織和非淋巴組織,是影響效應(yīng)性和記憶性T細(xì)胞功能的重要共刺激分子。其受體PD-1(programmed death 1)與CTLA-4結(jié)構(gòu)相似,是CD28家族的第4個成員,胞外區(qū)氨基酸序列上與CTLA-4分子的有24%同源性,主要以單體形式表達(dá)于活化的CD4+T和CD8+T細(xì)胞及B細(xì)胞表面。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):B7-H1結(jié)合PD-1后,能抑制已經(jīng)活化的T細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子,特別是能夠顯著抑制效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的活化。在T細(xì)胞受到抗原刺激時,B7-H1/PD-1信號通路能拮抗正性的B7-CD28共刺激信號,提示B7-H1/PD-1信號通路對T細(xì)胞應(yīng)答具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。B7-H1在非淋巴組織的表達(dá),提示它們可以下調(diào)自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞在外周組織中的應(yīng)答,可能參與自身耐受的形成。研究證實(shí),增強(qiáng)B7-H1的表達(dá)可以下調(diào)已活化的T、B細(xì)胞在外周組織中的應(yīng)答,在維持外周T、B細(xì)胞耐受中發(fā)揮重要的作用。 本研究構(gòu)建了表達(dá)小鼠B7-H1基因的慢病毒載體,試圖通過B7-H1基因的表達(dá)在不同的小鼠品系間誘導(dǎo)同種異體皮膚移植耐受。為了探討B(tài)7-H1在誘導(dǎo)皮膚移植耐受中的作用及其生物學(xué)功能,我們完成了如下四部分工作: 1.構(gòu)建表達(dá)小鼠B7-H1基因的慢病毒穿梭載體plenti6/V5-D-TOPO/mB7-H1重組子:用RT-PCR方法從C57BL/6小鼠肝臟組織中克隆獲得B7-H1 cDNA全長ORF,并定向克隆到plenti6/V5-D-TOPO載體,經(jīng)測序證實(shí)無突變。 2.表達(dá)小鼠B7-H1基因的慢病毒的包裝:在293FT包裝細(xì)胞完成了表達(dá)B7-H1基因的慢病毒包裝。測定B7-H1重組慢病毒和空病毒的滴度分別為3.4×108TU/ml和8.5×108TU/ml。病毒感染B16F10細(xì)胞后,免疫組織化學(xué)法證實(shí)B16F10細(xì)胞表面有B7-H1和V5蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測慢病毒感染B16F10細(xì)胞后B7-H1融合蛋白的陽性率為36%。 3. B7-H1重組腺病毒的制備和鑒定。B7-H1重組腺病毒為段文元博士制備成功,鑒定正確的重組腺病毒大量擴(kuò)增,通過GFP熒光計數(shù)法測定B7-H1重組腺病毒和對照空病毒的滴度分別為1×1012 TU /ml和3×1012 TU /ml。 4. B7-H1在延長同種異體皮膚移植存活時間中的作用:以C57BL/6小鼠為供皮鼠,BALB/c小鼠為受皮鼠行同種異體皮膚移植。將70只BALB/c小鼠隨機(jī)分為:正常對照組(A組)、環(huán)孢霉素A (CsA)處理組(B組)、B7-H1重組慢病毒處理組(C組,LV/B7-H1)、慢病毒空病毒載體處理組(D組,LV/B7-H0)、B7-H1重組腺病毒處理組(E組,AD/B7-H1),腺病毒空病毒載體處理組(F組,AD/B7-H0),B7-H1重組慢病毒和B7-H1重組腺病毒共處理組(G組,LV/B7-H0+AD/B7-H1),每組10只。 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,從A組到G組移植皮片平均存活時間(Mean survival time,MST)分別為:10.80士1.87;14.80士3.43;20.5士4.30;11.1士2.42;15.6士2.32;10.7士2.06和16.1士2.73天。A、D、F皮膚移植物的MST無顯著性差異(P0.05),說明單純使用慢病毒、腺病毒載體對移植皮片的存活無明顯影響;而B、C、E、G組MST與A組比較均明顯延長,有顯著性差異(P0.01),說明病毒載體介導(dǎo)B7H1同免疫抑制劑CsA一樣可以抑制同種異體皮膚移植排斥反應(yīng);C、E、G組與B組比較移植皮片平均存活時間有顯著性差異(P0.05),說明B7-H1基因轉(zhuǎn)染供體移植物后抑制排斥反應(yīng)的作用比CsA更為顯著;C組MST較E、G組顯著延長(P0.01),而E、G組MST差異不明顯(P0.05),顯示B7-H1慢病毒抑制同種異體皮膚移植排斥反應(yīng)的能力較B7-H1腺病毒為高,但慢病毒和腺病毒共轉(zhuǎn)染并無相加作用。
[Abstract]:the immune tolerance of the host immune system to the graft can be fundamentally solved due to the immune tolerance of the host immune system to the donor . B7 - H1 ( programmed death 1 ) is similar to the structure of T cells . It is the fourth member of the CD28 family . The B7 - H1 / PD - 1 signal pathway can inhibit the activation of activated T cells and secrete cytokines , especially the activation of CD8 + T cells . In order to investigate the role of B7 - H1 in inducing skin graft tolerance and its biological function , we completed the following four parts : 1 . Construction of a mouse B7 - H1 gene was constructed by using RT - PCR to clone the full - length ORF of B7 - H1 cDNA from the liver tissues of C57BL / 6 mice . 2 . The expression of B7 - H1 gene was expressed in 293FT packaging cells . The titer of B7 - H1 recombinant lentivirus and air virus was 3.4 脳 108 TU / ml and 8.5 脳 108 TU / ml , respectively . After virus infection of B16F10 cells , the expression of B7 - H1 and V5 protein was confirmed by immunohistochemical method . The positive rate of B7 - H1 fusion protein was 36 % . 3 . Preparation and identification of B7 - H1 recombinant adenovirus . B7 - H1 recombinant adenovirus was successfully used to identify the correct recombinant adenovirus . The titer of B7 - H1 recombinant adenovirus and control air virus was 1 脳 1012 TU / ml and 3 脳 1012 TU / ml respectively by GFP fluorescence counting method . 7 BALB / c mice were randomly divided into two groups : normal control group ( group A ) , cyclosporine A ( CsA ) treatment group ( group B ) , B7 - H1 recombinant lentivirus treatment group ( group D , LV / B7 - H1 ) , adenovirus empty virus vector treatment group ( group E , AD / B7 - H1 ) , adenovirus empty vector treatment group ( group F , AD / B7 - H ) , B7 - H1 recombinant lentivirus and B7 - H1 recombinant adenovirus co - treatment group ( group G , LV / B7 - ho + AD / B7 - H1 ) . The mean survival time ( MST ) was 10.80 + 1.87 , 14.80 + 3.43 , 20.5 + 4.30 , 11.1 + 2.42 , 15.6 + 2.32 , 10.7 + 2.06 and 16.1 + 2.73 days .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉向陽;盧永昕;徐玉蘭;李小青;劉雋;李愛華;羅萍;萬建平;;人生長激素慢病毒載體的構(gòu)建及其在鼠骨骼肌成肌細(xì)胞中的表達(dá)[J];生物工程學(xué)報;2006年02期

2 關(guān)健,陳杰,趙和;四環(huán)素調(diào)控表達(dá)的反義bcl-2對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-MC生長和凋亡的作用[J];中華病理學(xué)雜志;2002年02期

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本文編號：1500948