為了構建PLAC8蛋白敲除的人胚腎細胞株(293T)并檢測其對293T細胞增殖的影響,基于CRISPR/Cas9基因編輯技術及流式細胞分選術構建敲除PLAC8蛋白的293T細胞株,通過基因組測序及錯配酶酶切進行編輯細胞系的篩選。用篩選得到的細胞系提取細胞總蛋白,通過蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測編輯效率。進一步通過細胞生存實驗(MTT實驗)檢測敲除PLAC8對293T細胞增殖的影響,通過蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測敲除PLAC8蛋白后293T細胞中增殖相關基因的表達水平變化。結果表明,成功構建了PLAC8蛋白敲除的細胞系。與野生型細胞系相比,PLAC8表達下調會抑制細胞增殖,且在這一過程中AKT、RAF-1、ERK2、C-MYC等4個與增殖相關基因的蛋白水平改變,提示PLAC8可能通過AKT及RAF-1-ERK2-C-MYC這一級聯通路信號調控細胞增殖。

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圖1PLAC8基因結構特征及sgRNA設計

為確定細胞是否被編輯,需要對基因組進行測序檢測。因此我們使用軟件PrimerPremier5分別在兩個sgRNA潛在靶點的上下游200～300bp處各設計了一對檢測引物(PLAC8-AF/AR,PLAC8-DF/DR),見圖1。引物序列見表2。1.3PX458-sgRN....

圖2敲除PLAC8基因的293T細胞株的構建

接下來,我們用lipo3000轉染試劑將構建好的兩個打靶載體分別轉染到293T細胞中,48h后汞燈觀察細胞內的綠色熒光,判斷轉染效率(圖2)。由圖2可知,PX458-sgRNA-S1和PX458-sgRNA-S2這兩個質粒都成功轉染到293T細胞中,轉染效率約為80%。2.2....

圖3PLAC8敲除細胞株的驗證

為了進一步檢測KD1、KD2細胞株基因組編輯的效率,對KD1、KD2細胞株的總蛋白進行了WesternBlot實驗,用野生型293T細胞做陰性對照。結果顯示KD1、KD2細胞株中的PLAC8蛋白已經被完全敲除(圖3-d)。2.3PLAC8蛋白表達下調對293T細胞增殖的影....

圖4PLAC8表達下調對293T細胞增殖的影響

將KD1、KD2細胞系與野生型293T細胞系,分別取對數期細胞以2000/孔的細胞密度接種到96孔板中,用5mg/mL的MTT檢測細胞的生長速度并分析數據。結果顯示KD1、KD2細胞系的生長速度均明顯慢于WT細胞系,具有統(tǒng)計學意義(圖4-a)。為了進一步分析PLAC8敲除....

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