發(fā)布時(shí)間：2024-04-07 01:18

　　為了構(gòu)建PLAC8蛋白敲除的人胚腎細(xì)胞株(293T)并檢測(cè)其對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響,基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及流式細(xì)胞分選術(shù)構(gòu)建敲除PLAC8蛋白的293T細(xì)胞株,通過(guò)基因組測(cè)序及錯(cuò)配酶酶切進(jìn)行編輯細(xì)胞系的篩選。用篩選得到的細(xì)胞系提取細(xì)胞總蛋白,通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)編輯效率。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞生存實(shí)驗(yàn)(MTT實(shí)驗(yàn))檢測(cè)敲除PLAC8對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響,通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)敲除PLAC8蛋白后293T細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了PLAC8蛋白敲除的細(xì)胞系。與野生型細(xì)胞系相比,PLAC8表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制細(xì)胞增殖,且在這一過(guò)程中AKT、RAF-1、ERK2、C-MYC等4個(gè)與增殖相關(guān)基因的蛋白水平改變,提示PLAC8可能通過(guò)AKT及RAF-1-ERK2-C-MYC這一級(jí)聯(lián)通路信號(hào)調(diào)控細(xì)胞增殖。

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【部分圖文】：

圖1PLAC8基因結(jié)構(gòu)特征及sgRNA設(shè)計(jì)

為確定細(xì)胞是否被編輯,需要對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。因此我們使用軟件PrimerPremier5分別在兩個(gè)sgRNA潛在靶點(diǎn)的上下游200～300bp處各設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)引物(PLAC8-AF/AR,PLAC8-DF/DR),見(jiàn)圖1。引物序列見(jiàn)表2。1.3PX458-sgRN....

圖2敲除PLAC8基因的293T細(xì)胞株的構(gòu)建

接下來(lái),我們用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的兩個(gè)打靶載體分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,48h后汞燈觀察細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光,判斷轉(zhuǎn)染效率(圖2)。由圖2可知,PX458-sgRNA-S1和PX458-sgRNA-S2這兩個(gè)質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染效率約為80%。2.2....

圖3PLAC8敲除細(xì)胞株的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步檢測(cè)KD1、KD2細(xì)胞株基因組編輯的效率,對(duì)KD1、KD2細(xì)胞株的總蛋白進(jìn)行了WesternBlot實(shí)驗(yàn),用野生型293T細(xì)胞做陰性對(duì)照。結(jié)果顯示KD1、KD2細(xì)胞株中的PLAC8蛋白已經(jīng)被完全敲除(圖3-d)。2.3PLAC8蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)293T細(xì)胞增殖的影....

圖4PLAC8表達(dá)下調(diào)對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響

將KD1、KD2細(xì)胞系與野生型293T細(xì)胞系,分別取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以2000/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板中,用5mg/mL的MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度并分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示KD1、KD2細(xì)胞系的生長(zhǎng)速度均明顯慢于WT細(xì)胞系,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4-a)。為了進(jìn)一步分析PLAC8敲除....

本文編號(hào)：3947450