重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究
發(fā)布時(shí)間:2020-12-11 01:36
目的本研究旨在構(gòu)建并制備增強(qiáng)型熒光蛋白(EGFP)基因和Klotho基因重組腺病毒載體AdEGFP-Klotho,并將其感染HEK293細(xì)胞,為基因治療提供研究基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)含有NheⅠ與NotⅠ雙酶切位點(diǎn)的引物,應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增Klotho基因,將其連接到EGFP標(biāo)記的pDC316-mCMV穿梭質(zhì)粒上,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho,利用Polyfectin脂質(zhì)體將骨架質(zhì)粒和重組穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行同源重組,得到重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho,并包裝擴(kuò)增,測(cè)定病毒顆粒數(shù)及滴度。采用PCR方法對(duì)重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行Klotho基因測(cè)序。結(jié)果經(jīng)PCR和NheⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定,重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho中證實(shí)含有Klotho基因,測(cè)序結(jié)果和設(shè)計(jì)序列比對(duì)一致,重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho構(gòu)建成功。滴度為2.0×1010 Tu/mL,成功感染HEK293細(xì)胞,感染復(fù)數(shù)(MOI)=100,感染效率達(dá)91.75%,從Ad-EGFP-Klotho重組腺病毒載體中可以檢測(cè)到...
【文章來源】:重慶醫(yī)學(xué). 2019年23期 第3970-3973頁
【文章頁數(shù)】:4 頁
【部分圖文】:
重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-Klotho酶切鑒定結(jié)果
重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染8d后細(xì)胞表現(xiàn)出CPE現(xiàn)象,置于熒光顯微鏡下觀察,可見大量表達(dá)EGFP,見圖3。圖3 Klotho和EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達(dá)圖
Klotho和EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達(dá)圖
【參考文獻(xiàn)】:
期刊論文
[1]重組腺病毒載體Ad5-hTRX-EGFP的構(gòu)建及其表達(dá)[J]. 扈江偉,王軍,徐曼,蘇永鋒,孔維霞,盛紅霞,張斌,陳虎. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 2012(03)
本文編號(hào):2909659
【文章來源】:重慶醫(yī)學(xué). 2019年23期 第3970-3973頁
【文章頁數(shù)】:4 頁
【部分圖文】:
重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-Klotho酶切鑒定結(jié)果
重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染8d后細(xì)胞表現(xiàn)出CPE現(xiàn)象,置于熒光顯微鏡下觀察,可見大量表達(dá)EGFP,見圖3。圖3 Klotho和EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達(dá)圖
Klotho和EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達(dá)圖
【參考文獻(xiàn)】:
期刊論文
[1]重組腺病毒載體Ad5-hTRX-EGFP的構(gòu)建及其表達(dá)[J]. 扈江偉,王軍,徐曼,蘇永鋒,孔維霞,盛紅霞,張斌,陳虎. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 2012(03)
本文編號(hào):2909659
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