微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）是隸屬于頂復合器門的專性腸道細胞內(nèi)寄生原蟲，對免疫功能正常的宿主可引起自限性腹瀉，但是對免疫功能缺陷的宿主如艾滋病患者則具有潛在的生命威脅。目前，還沒有有效的藥物治療隱孢子蟲感染，因此，疫苗研制是防控本病感染的一個重要策略。本研究應用多個抗原表位預測軟件對微小隱孢子蟲CP15、P23和CP15/60三個子孢子表面抗原的多肽序列進行了T細胞表位預測及分析，從中選取了三個抗原表位富集的基因片段，利用重疊延伸PCR技術(shù)將該三個基因的全序列和三個篩選的表位富集片段序列分別進行串聯(lián)，各基因片段之間以柔性氨基酸（GGGGS）的堿基序列連接，得到融合基因CP15-P23-CP15/60和CpTm，將其分別克隆到原核表達載體pET28（a+）上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-CP15-23-60和pET-CpTm，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達，將純化的重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體。結(jié)果顯示兩個融合基因在大腸桿菌中高效表達，Western blot分析顯示重組蛋白能被�？刮⑿‰[孢子蟲陽性血清及隱孢子蟲鼠基因型CP... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

重疊延伸PCR串聯(lián)擴增三個目的基因片段Fig.2.1ConnectionofthreegenefragmentsbyoverlapextensionPCR

25為 1185 bp（圖 2.2-C），CpTm 融合基因的大小為 816 bp（圖 2.2-F），均與預期相符。圖2.2 融合基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果A：CP15、P23、CP15/60基因的PCR擴增；B：融合基因CP15-P23的PCR擴增；C：融合基因CP15-P23-CP15/60的PCR擴增；D：P1、P2、P3基因的PCR擴增；E：融合基因P1-2的PCR擴增；F：融合基因CpTm的PCR擴增；M：100bp DNA分子質(zhì)量標準；M1：DNA標準DL2000；1：CP15基因擴增片段；2：P23基因擴增片段；3：CP15/60基因擴增片段；4：CP15-P23基因擴增片段；5：CP15-P23-CP15/60基因擴增片段；6：P1基因擴增片段；7：P2基因擴增片段；8：P3基因擴增片段；9：P1-2基因擴增片段；10：CpTm基因擴增片段Fig. 2.2 Electrophoretic result of PCR product of fusion geneA: PCR amplification of CP15, P23 and CP15/60 genes; B: PCR amplification of CP15-P23 fusion gene; C: PCRamplification of CP15-P23-CP15/60 fusion gene; D: PCR amplification of P1, P2 and P3 genes; E: PCR amplification ofP1-2 fusion gene; F; PCR amplification of CpTm fusion gene; M: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker DL2000; 1:PCR product of CP15 gene; 2: PCR product of P23 gene; 3: PCR product of CP15/60 gene; 4: PCR product of CP15-P23fusion gene; 5: PCR product of CP15-P23-CP15/60 fusion gene;6: PCR product of P1 gene; 7: PCR product of P2 gene;8: PCR product of P3 gene; 9: PCR product of P1-2 fusion gene; 10: PCR product of CpTm fusion gene2.3.3 原核表達質(zhì)粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的鑒定以菌液為模板，進過25個循環(huán)的PCR擴增，結(jié)果成功地重疊延伸PCR出了CP15-P23-CP15/60和 CpTm

鍯P15-P23-CP15/60基因及其主要抗原表位區(qū)的串聯(lián)表達26圖2.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳結(jié)果M：100 bp DNA分子質(zhì)量標準；M1：DNA分子量標準Ⅳ；1：重組質(zhì)粒pET-CP15-23-60 的PCR產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pET-CpTm的PCR產(chǎn)物Fig. 2.3 Electrophoretic result of recombinant plasmids identified by PCR ampliflicationM: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker Ⅳ; 1: PCR product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60; 2: PCRproduct of recombinant plasmid pET-CpTm圖2.4 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果M：DNA分子量標準Ⅳ；1：pET-CP15-23-60重組質(zhì)粒EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；2：pET-CpTm重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ、SalⅠ雙酶切產(chǎn)物Fig. 2.4 Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmidsM: DNA Marker Ⅳ; 1: product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60 digested by EcoRⅠand XhoⅠ; 2: product ofrecombinant plasmid pET-CpTm digested by EcoRⅠand SalⅠ2.3.4 重組質(zhì)粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的誘導表達及純化將重組質(zhì)粒 pET-CP15-23-60 和 pET-CpTm 轉(zhuǎn)化入表達菌 BL21（DE3），經(jīng) IPTG（終濃度為1 mmol/L）37 ℃誘導表達 6 h，表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn) pET-CP15-23-60 的 5 號菌落和pET-CpTm 的 4 號菌落重組蛋白表達量較高（圖 2.5），重組表達蛋白大小分別約為 55 ku 和 43 ku；表達時相結(jié)果顯示兩個重組蛋白誘導表達超過 6 h 后表達量增多不明顯；不同表達形式分析結(jié)果顯示，兩個重組蛋白均為可溶性表達（圖 2.6）；表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后能得到較純的重組蛋白（圖2.7）。

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本文編號：2902911