發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 22:33

　　 登革病毒(Dengue virus,DENV)是目前最流行的蚊媒病毒之一,其廣泛流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)。DENV引起的一系列的癥狀如登革出血熱/登革休克綜合征(Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome,DSS/DHF)已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的健康。DENV作為黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,缺乏精確的復(fù)制校正系統(tǒng),在長期傳播過程中病毒的核苷酸會(huì)發(fā)生變化最終導(dǎo)致病毒毒力變強(qiáng)亦或是變?nèi)?其次,病毒侵染機(jī)體會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的宿主反應(yīng),二者相互作用的結(jié)果影響著病毒的長期毒力。所以這兩方面的因素對(duì)DENV感染后是否致病以及疾病的嚴(yán)重程度起著至關(guān)重要的作用。因此,進(jìn)一步找尋DENV毒力相關(guān)位點(diǎn)以及研究病毒與宿主的相互作用具有重要意義。在過去的25年,中國廣東省每年都有報(bào)告登革熱病例,在2014年出現(xiàn)了歷史高峰,當(dāng)年的病毒主要以血清型1的DENV(DENV1)為主。我們實(shí)驗(yàn)室獲取了 2014年廣東省登革熱爆發(fā)期間從急性期病人血清中分離得到的DENV-1型5種變異株,分別命名為 DENV1A、DENV1B、DENV1C、DENV1D、DENV1E。為了研究不同基因型的DENV-1的復(fù)制及毒力差異,我們首先用這5種變異株分別感染人胚腎細(xì)胞(293T)和蚊蟲細(xì)胞(C6/36),觀察病毒體外復(fù)制能力的強(qiáng)弱;其次,通過病毒感染乳鼠實(shí)驗(yàn),分析5種變異株的體內(nèi)毒力差異。體內(nèi)體外結(jié)果顯示,5種變異株中的DENV1B在哺乳動(dòng)物細(xì)胞及蚊蟲細(xì)胞中的復(fù)制能力以及對(duì)乳鼠神經(jīng)毒力都較其他變異株強(qiáng)。相反,DENV1E則最弱。為了進(jìn)一步了解5種變異株毒力強(qiáng)弱的分子機(jī)制,我們分別從變異株逃逸宿主天然免疫的能力以及毒株自身蛋白結(jié)構(gòu)及功能兩個(gè)方面來研究。(1)5種變異株逃逸宿主天然免疫的能力:DENV感染宿主時(shí),天然免疫系統(tǒng)作為抵御病毒入侵的第一道防線,會(huì)立即被激活。我們重點(diǎn)關(guān)注干擾素介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答機(jī)制,主要研究5種變異株的非結(jié)構(gòu)蛋白抑制干擾素(Interferon,IFN)產(chǎn)生的差異。我們分別構(gòu)建了5種變異株的非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),結(jié)果顯示,DENV1B的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2A、NS2B、NS4A)抑制RIG-I介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生較DENV1E強(qiáng)。與此同時(shí),我們通過定點(diǎn)突變登革病毒DNA型復(fù)制子(DGL2)NS2A第66位的氨基酸,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變后,病毒復(fù)制子的復(fù)制能力顯著變?nèi)酢５��?我們用病毒感染IFNAR-/-(I型干擾素受體缺陷)小鼠及其原代細(xì)胞意外地發(fā)現(xiàn),在干擾素介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答存在缺陷的情況下,DENV1B的病毒載量還是比DENV1E的高。于是,我們推測(cè)2種變異株逃逸宿主抗病毒免疫反應(yīng)的差異并不是導(dǎo)致DENV1B比DENV1E毒力強(qiáng)的唯一因素。病毒某些位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變致使自身蛋白結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變,也可能導(dǎo)致病毒株的復(fù)制能力及毒力變強(qiáng)或是變?nèi)酢?2)5種變異株自身結(jié)構(gòu)的差異:①通過高通量測(cè)序技術(shù)獲取了 5種變異株的全基因組序列,系統(tǒng)進(jìn)化分析:DENV1A/2014、DENV1B/2014和DENV1C/2014同屬于DENV-1型基因1型,DENV1D/2014和DENV1E/2014屬于DENV-1型基因V型。親緣關(guān)系上DENV1B與DENV1C接近,它們與DENV1D和DENV1E進(jìn)化距離最遠(yuǎn);②3'UTR比對(duì)分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:DENV1DE的3'UTR區(qū)存在缺失,二級(jí)結(jié)構(gòu)也不如DENV1ABC的穩(wěn)定;③DENV的NS3作為一種絲氨酸蛋白酶,對(duì)病毒蛋白的成熟起著至關(guān)重要的作用。NS2B作為輔因子激活酶在NS3絲氨酸蛋白酶的活化中起著關(guān)鍵作用。我們采用原核蛋白表達(dá)純化的方法,獲得了具有蛋白酶活性的DENV1B-NS2B3和DENV1E-NS2B3重組蛋白,通過酶活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DENV1B-NS2B3對(duì)底物的切割效率較高。序列比對(duì)結(jié)果顯示,兩種病毒的輔酶結(jié)構(gòu)域NS2B(H)的第55位的氨基酸有差異。我們將DENV1B-NS2B3蛋白中55位的賴氨酸(Lysine,K)突變?yōu)榫�氨�?Arginine,R),NS2B(H)-NS3蛋白酶切割底物的效率有所下降。我們進(jìn)一步通過定點(diǎn)突變DGL2 NS2B第55位的氨基酸,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變后顯著地削弱了病毒的復(fù)制能力。綜上所述,本研究主要比較了5種變異株的復(fù)制能力及毒力差異,發(fā)現(xiàn)了DENV1B的復(fù)制能力及毒力最強(qiáng)的,而DENV1E最弱。探索內(nèi)在分子機(jī)制的過程中,我們發(fā)現(xiàn)了 NS2A第66位氨基酸及NS2B第55位的氨基酸是病毒潛在的毒力決定位點(diǎn),為更好地理解DENV毒力強(qiáng)弱的分子機(jī)制提供了理論依據(jù),也為研究DENV蛋白功能,致病機(jī)制及新型減毒疫苗提供新思路。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

問題之一?［２］。??我國南方毗鄰東南亞登革熱疫區(qū)國家，白紋伊蚊分布廣泛，是登革熱疫情的??高危爆發(fā)流行地區(qū)［３］（圖１綠色箭頭標(biāo)注）。上世紀(jì)２０－４０年代，我國南方曾有過??登革熱流行，隨后銷聲匿跡數(shù)十年。直至１９７８年，廣東省佛山市發(fā)生登革熱爆發(fā)??流行，此后，我國南方地區(qū)登革熱疫情連年不斷，登革熱被認(rèn)為由輸入病例引起??的本地爆發(fā)疫情［４，?５］，尤其是廣東地區(qū)。廣州市是中國南方最大的大都市，人口??超過１３００萬，且廣州屬亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季炎熱潮濕，冬季溫和干燥，使得白??紋伊蚊在冬季依然能夠生存，因此，蚊蟲被認(rèn)為是唯一的登革熱傳播媒介。在過??去的幾十年里，廣州每年都有散發(fā)性流行病發(fā)生，ＤＥＮＶ－１成為了主要流行毒株，??１９７８年至今累計(jì)登革熱病例７０余萬例，占全國總病例數(shù)９０％以上［６，?７］，更是發(fā)??生過歷史上三次登革熱大爆發(fā)（１９８０

??｜?ｉ?□?２＿?ｎ?■丨．??ｉ?Ｔ?Ｅ＾ｐ，?Ｕ?Ｈ?１??Ｉ?ｏｉ?．?ｆ?ｉｔ．?ｎｉｌｎ．?Ｊｉ?Ｊ??ｉＴ＾Ｔ，ｎｎｉｕｍ?ｉｉｉｉｉｉｎｉｉｉｉ?關(guān)〇圓??ｕ?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｕｊ?ｇ?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｌｕ?＾?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｕｊ?＾?－ｇ?＜?ｍ?ｏ?ｑ?ｕｊ?ｇ??１１１１１１°?１１１１１１°?１１１１１１°?ｌｌｉｌｌｌＱ??圖１．１病毒在人源細(xì)胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）中復(fù)制能力的差異??１．２相同劑量的登革病毒感染蚊蟲細(xì)胞Ｃ６／３６，熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)ＤＥＮＹ１??ＲＮＡ的拷貝數(shù)??為了進(jìn)一步了解病毒在中間宿主白紋伊蚊中的復(fù)制能力的差異。同理，我們??是采用相同劑量的病毒感染白紋伊蚊細(xì)胞Ｃ６／３６，分別于感染后１２?ｈ、２４?ｈ、４８??７２?ｈ后，收集上清以及裂解細(xì)胞，利用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＰＣＲ分析病毒ＲＮＡ復(fù)制量，??果也顯示ＤＥＮＶ１Ｂ、ＤＥＮＶ１Ｃ早期復(fù)制得比ＤＥＮＶ１Ｄ和ＤＥＮＶ１Ｅ快（圖１．２）。??＞．?Ｉ??

的乳鼠約１０－１１?ｄ開始出現(xiàn)上述癥狀，最終死亡；接種ＤＥＮＶ１Ｃ的乳鼠約１１－１２?ｄ??開始出現(xiàn)上述癥狀，最終死亡；而接種ＤＥＮＶ１Ａ、ＤＥＮＶ１Ｄ、ＤＥＮＶ１Ｅ的乳鼠發(fā)??病的時(shí)間較晚，約１３－１５?ｄ才開始出現(xiàn)癥狀。結(jié)果如圖１．３所示：??１〇〇１?—￣［ｐｔ］?“?ＰＢＳ（ｎ＝７）??？?８０－?Ｌ，?ＤＶ１－Ａ（ｎ＝２０）??Ｉ?Ｌ?＂Ｔ??ＤＶ１－Ｂ（ｎ＝２５）??＝６０＇?１?－＊？?ＤＶ１－Ｃ（ｎ＝２８）??ＤＶ１－Ｄ（ｎ＝２４）??〇?Ｉ?Ｉ?ＤＶ１－Ｅ（ｎ＝２７）??＾?２０－?｜??＿?ＤＥＮＶ２（ｎ＝２９）??〇－?１１￣Ｉ?Ｉ??６?５?１０?１５?２０??Ｄａｙｓ?ｐｏｓｔ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??圖１．３乳鼠顱腦接種ＤＥＮＶｌ后的生存曲線??１．４接種ＤＥＮＶ１后乳鼠顱腦中的病毒復(fù)制量??同時(shí)，將乳鼠顱腦勻漿，提取組織ＲＮＡ，熒光定量ＰＣＲ分析乳鼠顱腦中病毒??ＲＮＡ的載量。數(shù)據(jù)結(jié)果與生存曲線一致：ＤＥＮＶＩＢ、ＤＥＮＶ１Ｃ的病毒載量比??ＤＥＮＶ１Ｄ?和?ＤＥＮＶ１Ｅ?的高（圖?１．４）。??９??
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本文編號(hào)：2892093