發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 06:40

　　 釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae,簡(jiǎn)稱S.cerevisiae)是一種單細(xì)胞真核微生物,廣泛用于食品工業(yè),因而被認(rèn)為是安全。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,它的基因組序列已經(jīng)被完全測(cè)定,開發(fā)出了許多能應(yīng)用于釀酒酵母中的表達(dá)載體。寨卡病毒(Zika virus,簡(jiǎn)稱ZIKV)歸屬于黃病毒科,黃病毒屬,是一種蟲媒病毒,具有傳播速度快、波及范圍廣的特點(diǎn),因此研制安全有效的疫苗毫無疑問是當(dāng)務(wù)之急。盡管對(duì)ZIKV的致病機(jī)制有了一定深度的研究,但是非常遺憾的是,目前沒有有效的抗病毒藥物或疫苗用于治療或預(yù)防ZIKV感染。毋庸置疑,接種疫苗是預(yù)防ZIKV感染和疫情大爆發(fā)最有效的措施之一。因此研發(fā)安全有效的疫苗是重中之重。本論文以ZIKV表面具有免疫原性的Envelope(包膜)基因作為研究對(duì)象,構(gòu)建表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-Envelope,并對(duì)其免疫活性進(jìn)行分析,目的是建立以表面展示型釀酒酵母為基礎(chǔ)的病毒口服疫苗遞送技術(shù)平臺(tái)。(1)通過常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建了表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-Envelope。以Zika/SZ01/2016基因?yàn)槟０?在上游引物中設(shè)計(jì)Nhe I酶切位點(diǎn),下游引物設(shè)計(jì)EcoR I酶切位點(diǎn)并含終止密碼子(TAA),經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的Envelope基因與質(zhì)粒pYD1分別經(jīng)Nhe I/EcoR I雙酶切后進(jìn)行連接,再轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將篩選的陽性克隆提取質(zhì)粒DNA,命名為:pYD1-Envelope。后電轉(zhuǎn)至EBY100感受態(tài)細(xì)胞,篩選的陽性釀酒酵母命名為:EBY100/pYD1-Envelope。(2)為檢測(cè)Envelope蛋白在釀酒酵母的表達(dá)定位,通過Western blot對(duì)EBY100/pYD1-Envelope的上清和沉淀裂解物進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,Envelope蛋白表達(dá)在了EBY100/pYD1-Envelope細(xì)胞內(nèi)。通過多克隆抗-Envelope血清對(duì)EBY100/pYD1-Envelope表面進(jìn)行處理,經(jīng)免疫熒光和流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果表明EBY100/pYD1-Envelope表面有特異性的抗原蛋白存在。此外,通過BCA蛋白定量試劑盒對(duì)Envelope抗原蛋白含量進(jìn)行測(cè)定,其表達(dá)量為:0.3305μg/OD_(600nm)。(3)表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的免疫活性分析。通過ELISA檢測(cè)Envelope特異性血清IgG、IgM抗體效價(jià)和糞便IgA抗體水平,考察了Regimen1、Regimen2、Regimen3三種免疫方案,結(jié)果表明Regimen3為最優(yōu)免疫方案�；�于釀酒酵母表面展示技術(shù),成功地構(gòu)建了EBY100/pYD1-Envelope,并建立了Envelope抗原蛋白的表面分析檢測(cè)平臺(tái)。通過ELISA檢測(cè)Envelope特異性抗體效價(jià),建立了口服免疫的抗體應(yīng)答分析平臺(tái)。本論文僅以ZIKV的Envelope基因組作為一個(gè)研究支點(diǎn),而釀酒酵母表面展示技術(shù)是一個(gè)通用平臺(tái),這對(duì)研發(fā)其他病毒或細(xì)菌疫苗提供了新的研究策略和方法。
【學(xué)位單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R346;R392
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 研究背景與意義
    1.2 酵母研究概況
        1.2.1 酵母的分類
        1.2.2 釀酒酵母表面展示系統(tǒng)及其優(yōu)勢(shì)
        1.2.3 基于釀酒酵母表面展示系統(tǒng)構(gòu)建的病毒疫苗研究進(jìn)展
        1.2.4 釀酒酵母作為口服疫苗遞送載體的優(yōu)勢(shì)
    1.3 ZIKV簡(jiǎn)介
        1.3.1 ZIKV感染對(duì)人類健康的危害
        1.3.2 ZIKV結(jié)構(gòu)分析
        1.3.3 ZIKV疫苗的研究進(jìn)展
    1.4 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線
第2章 表面展示型釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料
        2.2.1 儀器
        2.2.2 材料
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 Envelope基因DNA濃度測(cè)定
        2.3.2 Envelope基因的擴(kuò)增和酶切分析
        2.3.3 pYD1質(zhì)粒的提取與酶切分析
        2.3.4 質(zhì)粒pYD1-Envelope的構(gòu)建
        2.3.5 表面展示型釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 Envelope基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.4.2 質(zhì)粒pYD1的酶切分析
        2.4.3 質(zhì)粒pYD1-Envelope的酶切鑒定
        2.4.4 Envelope目標(biāo)基因的PCR鑒定
    2.5 討論
第3章 表面展示型釀酒酵母中Envelope蛋白的定位鑒定及定量分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料
        3.2.1 儀器
        3.2.2 材料
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 表面展示型釀酒酵母表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        3.3.2 表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析
        3.3.3 免疫熒光分析
        3.3.4 流式細(xì)胞儀分析
        3.3.5 蛋白濃度測(cè)定
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 表面展示型釀酒酵母表達(dá)載體生長(zhǎng)曲線
        3.4.2 Westernblot分析
        3.4.3 免疫熒光分析
        3.4.4 流式細(xì)胞分析
        3.4.5 蛋白濃度的測(cè)定
    3.5 討論
第4章 表面展示型釀酒酵母EBY100/pYD1-Envelope免疫活性分析
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料
        4.2.1 儀器
        4.2.2 材料
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 免疫前準(zhǔn)備
        4.3.2 Envelope特異性血清IgG的檢測(cè)方法
        4.3.3 Envelope特異性血清IgM的檢測(cè)方法
        4.3.4 Envelope特異性糞便IgA的檢測(cè)方法
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 不同免疫方案對(duì)血清IgG的影響
        4.4.2 不同免疫方案對(duì)血清IgM的影響
        4.4.3 不同免疫方案對(duì)糞便IgA的影響
    4.5 討論
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文

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本文編號(hào)：2891097