發(fā)布時間：2020-11-16 11:55

　　 背景了解細菌蛋白對免疫細胞的作用效應(yīng)是評價其是否能用于抵抗細菌感染的重要依據(jù)。PepO是一種細菌中保守存在的肽鏈內(nèi)切酶類蛋白,其缺陷菌株粘附和侵襲能力較野生菌株明顯減弱,是肺炎鏈球菌中一個新毒力因子。我們的研究顯示PepO有強烈的肺部致炎作用,但其導致的免疫效應(yīng)和具體機制尚不清楚。肺泡巨噬細胞在宿主防御呼吸道細菌感染中發(fā)揮著重要作用,肺部對肺炎鏈球菌的清除始于巨噬細胞,因此本研究擬以巨噬細胞為研究對象,探究PepO對巨噬細胞的作用效應(yīng)及相關(guān)機制。方法經(jīng)典吞噬實驗觀察PepO刺激腹腔來源的巨噬細胞后其吞噬能力的改變;Q-PCR檢測PepO誘導巨噬細胞的miR-155、SHIP1 mRNA的表達變化;Western blot檢測PepO誘導巨噬細胞的SHIP1、AKT、NF-k B蛋白表達變化;轉(zhuǎn)染miR-155的mimic或inhibitor,以過表達或降低該基因的胞內(nèi)水平,檢測巨噬細胞的吞噬能力改變和SHIP1mRNA表達水平的變化;采用信號通路抑制劑聯(lián)合PepO處理巨噬細胞,Q-PCR檢測miR-155的表達;采用熒光素酶報告基因檢測miR-155靶向SHIP1的熒光素酶活性;采用免疫熒光檢測巨噬細胞對細菌的吞噬能力改變,表面受體CR3表達情況,及NF-kB核轉(zhuǎn)位的變化。結(jié)果PepO處理巨噬細胞后,細胞對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的吞噬能力增強,呈劑量和時間依賴性。Q-PCR結(jié)果顯示,PepO刺激巨噬細胞后,其miRNA-155的表達較對照組顯著升高,呈劑量和時間依賴性。轉(zhuǎn)染miRNA-155抑制劑的巨噬細胞,PepO處理后其吞噬細菌的能力較轉(zhuǎn)染陰性對照的巨噬細胞顯著下調(diào),而轉(zhuǎn)染miRNA-155的mimic巨噬細胞的吞噬細菌能力較相應(yīng)對照細胞顯著上升,提示PepO可通過誘導miRNA-155的表達促進巨噬細胞的吞噬能力。熒光素酶報告SHIP1基因檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-155的細胞其熒光素酶活性較對照細胞顯著升高,證明miRNA-155的確能靶向調(diào)控SHIP1基因表達。Q-PCR和Western bloting結(jié)果顯示,PepO誘導的巨噬細胞較對照細胞的SHIP1表達顯著下調(diào),且呈劑量和時間依賴性。而轉(zhuǎn)染miRNA-155抑制劑的巨噬細胞,PepO處理后其SHIP1的mRNA表達水平較轉(zhuǎn)染陰性對照的巨噬細胞顯著下調(diào),轉(zhuǎn)染miRNA-155 mimic的巨噬細胞,PepO處理后其SHIP1的mRNA表達水平較轉(zhuǎn)染陰性對照的巨噬細胞顯著上調(diào),這些結(jié)果提示PepO可通過miRNA-155調(diào)控SHIP1的表達。CR3為巨噬細胞識別細菌的受體之一,有文獻提示其表達受SHIP1的負調(diào)控,我們的免疫熒光檢測結(jié)果顯示,PepO處理巨噬細胞后其CR3較陰性對照組顯著升高。這些結(jié)果提示PepO可能通過誘導miRNA-155下調(diào)SHIP1表達,從而促進CR3表達增加而提高巨噬細胞的吞噬能力。將PepO分別處理TLR2缺陷小鼠來源的腹腔巨噬細胞和野生鼠的巨噬細胞,結(jié)果顯示TLR2缺陷鼠的巨噬細胞表達miRNA-155較野生鼠顯著降低,其SHIP1的表達水平不隨PepO刺激的時間延長而降低,同時其CR3的表達水平也不像野生鼠的巨噬細胞,因PepO的刺激而顯著增高。抑制劑實驗結(jié)果顯示,Akt和NF-κB的抑制劑處理細胞后,PepO刺激的miRNA-155表達較未處理組顯著下調(diào)。PepO刺激后巨噬細胞的Akt磷酸化水平顯著增高,NF-κB的含量及入核量顯著增加,而TLR2缺陷鼠的巨噬細胞在受到PepO刺激后,仍存在Akt磷酸化水平增高,但NF-κB的含量及入核量無顯著改變,這些結(jié)果提示PepO主要依賴于TLR2-NF-κB通路誘導miRNA-155的表達上調(diào)。結(jié)論PepO可通過TLR2-NF-κB信號通路誘導miRNA-155表達增高,增強巨噬細胞的吞噬能力,該作用還可能與SHIP1表達的下調(diào)以及CR3表達上調(diào)相關(guān)。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R378.1
【文章目錄】：
英漢縮略語名詞對照
中文摘要
英文摘要
前言
1 實驗材料
2 實驗方法
3 實驗結(jié)果
4 討論
全文總結(jié)
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文

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本文編號：2886199