發(fā)布時間：2020-11-15 05:55

　　 【目的】人微小纖溶酶原是由261個氨基酸組成的肽鏈,位于人纖溶酶原第549～790位,含有纖溶酶原活性區(qū)域,被激活后具有纖溶活性,能夠降解纖維蛋白。本文旨在優(yōu)化人微小纖溶酶原cDNA在畢赤酵母中的表達條件。【方法】在NCBI中獲取人微小纖溶酶原氨基酸序列,根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性原理,設(shè)計對應(yīng)的DNA序列,然后進行人工合成。合成的基因序列經(jīng)測序驗證后酶切與表達載體pPICZαA連接形成重組表達質(zhì)粒pPICZαA-mPlg,轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中擴增質(zhì)粒,提取陽性菌落中的重組質(zhì)粒,雙酶切獲得人微小纖溶酶原的表達單元,然后構(gòu)建4拷貝(表達單元)pPICZαA-mPlg,單酶切線性化質(zhì)粒。然后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入感受態(tài)畢赤酵母SMD1168中,經(jīng)表型篩選、PCR篩選陽性克隆,獲得高表達人微小纖溶酶原工程菌。培養(yǎng)工程菌后,甲醇誘導(dǎo)工程菌細胞讓人微小纖溶酶c DNA表達,用SDS-PAGE檢查其分子量,發(fā)色底物法檢測微小纖溶酶原活性,通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高人微小纖溶酶原的產(chǎn)量,用SP-Sepharose fast flow凝膠層析方法純化目標蛋白。【結(jié)果】SDS-PAGE檢測到符合人微小纖溶酶原分子量大小的蛋白條帶,同時發(fā)色底物法檢測出樣品中含有纖溶活性,其水平達到90 U/mL�！窘Y(jié)論】本文為后續(xù)進行大規(guī)模表達人微小纖溶酶原打下了基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

使用發(fā)色底物法S-2403(pyroGlu-Phe-Lys-pNA·HCl)在波長為405 nm處檢測發(fā)色底物S-2403的吸光度,從而達到檢測人微小纖溶酶原的活性效果,將甲醇誘導(dǎo)4 d后的畢赤酵母菌液離心獲得的上清液作為樣品,長白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白分解酶為標品,尿激酶作為人微小纖溶酶原激活劑,50 mM Tris-HCl pH7.4作為緩沖液,37 ℃在96孔板中反應(yīng)。S-2403使用的濃度是0.3 mM,人微小纖溶酶原的檢測終濃度在1～10 nM。1.2.6 甲醇添加比對人微小纖溶酶原表達的影響

pH對活性的影響

pPICZαA-4mPlg被BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后,1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。一個人微小纖溶酶原的表達元件是2436 bp,4拷貝的人微小纖溶酶原為9744 bp。1～4號樣品中,都有一條接近10 000 bp的4拷貝條帶和3.6 kb的載體條帶。實驗結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致,表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。圖3 4拷貝重組蛋白表達載體構(gòu)建
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋鋼,宋后燕,茅翔;用計算機模型研究葡激酶與人微小纖溶酶原的相互作用[J];高技術(shù)通訊;1999年04期

2 宋鋼,官孝群,莫煒,宋后燕;人微小纖溶酶原活性中心絲氨酸突變體基因在畢赤酵母中的表達[J];藥物生物技術(shù);2000年04期

本文編號：2884418