志賀菌分為4個群,其中福氏志賀菌(Shigella flexneri, S. flexneri)是發(fā)展中國家引起細菌性腹瀉的主要病原菌。根據(jù)O-抗原的不同,福氏志賀菌至少可以分為19種血清型。O-抗原上四糖骨架中特定糖的糖基化或/和乙酰化、以及磷酸乙醇胺(Phophoethanolamine, PEtN)修飾形成了其血清型的多樣性。這種O-抗原的修飾是由血清型轉(zhuǎn)換噬菌體和質(zhì)粒所介導(dǎo)的。糖基化和乙�；揎検怯裳逍娃D(zhuǎn)換噬菌體所介導(dǎo)的；而磷酸乙醇胺修飾是由質(zhì)粒攜帶的opt基因?qū)EtN基團連接到四糖骨架上2號或3號位的鼠李糖(RhaⅡ, RhaⅢ)上完成的。我們實驗室發(fā)現(xiàn)有兩種opt基因,分別是pSFXv_2質(zhì)粒攜帶的optll和pSFyv_2質(zhì)粒攜帶的optⅢ。optⅡ優(yōu)先修飾RhaⅡ形成Xv血清型,optⅢ優(yōu)先修飾RhaⅢ形成Yv和4av血清型。 新的血清型Xv于2000年首先在河南出現(xiàn),隨后其分離率逐漸升高,于2002—2006年間取代2a血清型成為河南省的優(yōu)勢血清型。Xv血清型在中國的甘肅省、安徽省以及其他省份也相繼出現(xiàn),并一度成為當?shù)氐膬?yōu)勢血清型。我們以前的研究發(fā)現(xiàn),我國分離的Xv血清型菌株為序列型91(sequence type, ST91). ST91也是我國福氏志賀菌的優(yōu)勢序列型。通過對我國分離的Xv血清型菌株2002017(ST91)測序發(fā)現(xiàn),它的基因組含有血清型轉(zhuǎn)換噬菌體SfX,并通過pSFXv_2質(zhì)粒攜帶的opt基因?qū)-抗原進行PEtN修飾,轉(zhuǎn)換為新的Xv血清型。通過測序還發(fā)現(xiàn),它獲得了志賀菌耐藥島(Shigella resistance locus, SRL)和Tn7耐藥島。SRL和Tn7島攜帶多種耐藥基因。與首次發(fā)現(xiàn)并命名SRL島的日本菌株YSH6000相比,我國分離的福氏志賀菌2002017的SRL島有兩個特征,一是在SRL島上額外插入了1個編碼四環(huán)素耐藥蛋白的tet基因簇,所以在2002017上有2個與四環(huán)素耐藥相關(guān)的基因簇；二是沒有YSH6000上編碼轉(zhuǎn)鐵系統(tǒng)(ferric transport system)的fec基因簇。2002017的Tn7島序列與2457T(血清型2a,ST86)、Sf301(2a, ST18)、Sf8401(5b, ST93)和YSH6000(2a)菌株的相同,序列較為保守。 目前對福氏志賀菌優(yōu)勢克隆群的基因組進化及選擇壓力,新血清型在我國的流行、傳播特征均不清楚。另外國內(nèi)外也缺乏福氏志賀菌的全基因組信息,尚未建立起其進化關(guān)系。為了揭示我國福氏志賀菌這方面的基因組特征,本研究對14種血清型的59株福氏志賀菌(包括Xv[25株],X[9株],1a[7株],1b[1株],1d[1株],2a[5株],2b[1株],3a[3株],3b[1株],4a[1株],4av[1株],4b[1株],Y[2株]和Yv[1株]),7個序列型(包括ST91[50株],ST109[1株],ST18[3株],ST142[1株],ST143[1株],ST103[2株],ST16[1株])進行了全基因組測序。并與已經(jīng)公布序列的5株福氏志賀菌(2002017,Sf301,2457T,Sf8401和M90T)的基因組序列一起進行分析。通過掃描64株菌基因組上的耐藥島及耐藥基因后發(fā)現(xiàn),ST91序列型自20世紀90年代初期(1993年)開始出現(xiàn),通過獲得SRL和Tn7兩個多重耐藥島以及喹諾酮類藥物的耐藥基因gyrA上2個非同義突變,最終成為我國的優(yōu)勢克隆群�；诤诵幕�(core genome)上的1,790個高質(zhì)量單核苷酸位點(single-nucleotide polymorphism, SNP)構(gòu)建的BEAST進化樹顯示,Xv血清型菌株形成了各自獨立起源且分化時間不同的3個基因組群(genome cluster)。其中,群1是河南省的優(yōu)勢群,分化時間最早,為1999年,并在其他兩個省份廣泛傳播。隨后群3(安徽省的優(yōu)勢群)和群2(甘肅省的優(yōu)勢群)相隔1年相繼分化。提示Xv血清型的3個群具有多地起源和地域性的特征。 我們通過對59株菌的opt基因序列分析發(fā)現(xiàn),所有25株Xv血清型菌株均攜帶optⅡ基因,1株Yv血清型菌株攜帶optⅢ基因,3株X血清型菌株攜帶失活的optⅡ基因,其他菌株均未攜帶opt基因。與2002017攜帶的optⅡ相比,25株Xv菌株攜帶的optⅡ基因序列存在3種變化,有1個或2個堿基的差異。Yv血清型菌株攜帶的optⅢ基因與HN006菌株攜帶的optⅢ序列相差1個堿基。3株X血清型菌株雖然也攜帶optⅡ基因,但均有1個堿基的缺失,形成了終止密碼子,導(dǎo)致了optⅡ基因的失活。所有25株Xv菌株和3株X菌株均攜帶pSFXv_2質(zhì)粒,而其他菌株均未檢測到這個質(zhì)粒。群1和群2的pSFXv_2序列高度同源,而群3的質(zhì)粒序列與其他兩個群相差15個SNP。我們通過比較Xv血清型3個群菌株的染色體、pSFXv_2質(zhì)粒及opt基因的SNP發(fā)現(xiàn),染色體和pSFXv_2質(zhì)粒上的變化具有一致性,說明質(zhì)粒和染色體具有共進化的特征。而且群1和群2的基因組序列高度同源,可能具有共同起源,而群3是獨立起源的。 接下來為了驗證Xv血清型3個群的地域性特征,我們挑選18個群特異性(cluster-specific) SNP位點,使用Sequenom MassArray技術(shù),對我國分離的380株Xv血清型的菌株(河南[177株],甘肅[125株],安徽[78株])進行SNP分型。其中包括群1的4個SNP,群2的12個SNP,群3的2個SNP。18個SNP位點將380株菌分為5個SNP型別(SNP genotyping, SG)。SG1包括所有未分型的菌株。SG2和SG5分別對應(yīng)基因組群1和群3。SG3和SG4對應(yīng)基因組群2,因為在群2特有的12個SNP位點中有1個位點(SNP14)將群2分為2個SG。分型結(jié)果顯示,SG2和SG5分別是河南省和安徽省的優(yōu)勢SG型,而SG3和SG4是甘肅省的優(yōu)勢SG型。同時SG2是我國的優(yōu)勢SG型別。除了本地優(yōu)勢SG型外,我們還發(fā)現(xiàn)SG2型在其他兩個省份廣泛傳播,說明在一個地區(qū)內(nèi)還存在地域間傳播的菌株。 對攜帶SRL和Tn7耐藥島的50株ST91、1株ST109和1株ST142菌株基因組中2個耐藥島的編碼基因及核酸序列,與參考菌株2002017及YSH6000比對后發(fā)現(xiàn),9株ST91菌株的SRL耐藥島發(fā)生了插入或缺失。其中,7株缺失了編碼四環(huán)素耐藥蛋白的tet基因；1株缺失了編碼β-內(nèi)酰胺酶的oxa-1和編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的cat基因；1株在SRL島上獲得了1個編碼廣譜p-內(nèi)酰胺酶的bla TEM-1基因。所有50株ST91、1株ST109和1株ST142菌株攜帶的Tn7島的核酸序列和編碼基因與參考菌株相比未發(fā)現(xiàn)差異。說明我國ST91菌株的SRL島上發(fā)生了基因的插入和缺失,而Tn7島較為保守。另外,處于進化早期的家系III中的1株ST18菌株雖然沒有獲得完整的耐藥島,但攜帶島上的3個耐藥基因,而家系Ⅲ中的其他3株2a血清型的ST18菌株未獲得2個島。提示在ST91成為優(yōu)勢序列型之前,ST18序列型可能在我國已經(jīng)廣泛存在,而且在獲得耐藥島的過程中發(fā)揮重要作用。另外1株分離自20世紀80年代的ST16序列型的菌株,雖然沒有攜帶SRL和Tn7耐藥島,但攜帶YSH6000上的fec轉(zhuǎn)鐵基因簇。其基因序列和分離自上世紀60年代的日本菌株YSH6000的序列完全一致。說明fec基因簇在ST91成為中國優(yōu)勢序列型及Xv新血清型流行之前,就已經(jīng)存在了。 本研究初步建立了我國福氏志賀菌的進化關(guān)系。揭示了ST91自上世紀90年代初期開始出現(xiàn),在耐藥選擇壓力下不斷傳播,最終成為我國福氏志賀菌的優(yōu)勢克隆群。Xv血清型的3個群分別在河南省、甘肅省和安徽省獨立地獲得了攜帶opt基因的質(zhì)粒,分別完成了對O-抗原的磷酸乙醇胺修飾,成為了當?shù)氐膬?yōu)勢型。同時在一個地區(qū)內(nèi)還存在一定比例的地域間傳播的菌株,與優(yōu)勢型一起造成了新血清型在當?shù)氐牧餍小Ｒ虼?福氏志賀菌在我國的流行特征是本地優(yōu)勢型和區(qū)域間傳播共同造成的。
【學(xué)位單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R378.25
【文章目錄】：縮略詞表
論文摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
參考文獻
發(fā)表文章
附表
致謝
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本文編號：
2883772
