發(fā)布時間：2017-04-17 15:52

前 言

呼腸病毒顆粒為無包膜的二十面體結構。其外層衣殼網格（outer capsidlatice）的主體由 600 個 μ1 蛋白以三聚體形式構成。μ1 蛋白是病毒顆粒的穿膜蛋白，它與 σ3 緊密聯結，并受到 σ3 蛋白的保護。σ3 蛋白也一同構成病毒衣殼。σ1 蛋白是病毒黏附蛋白（attachment protein），呈纖維狀，共36 個，它們以三聚體形式位于毒粒外衣殼的 12 個頂角上，介導病毒對宿主細胞的入侵。呼腸病毒對宿主細胞的感染首先以黏附蛋白 σ1 結合細胞受體開始，然后病毒顆粒以酷似受體介導的內吞方式進入細胞,形成胞內小泡（endocyticvesicles）。在胞內小泡中產生了與感染性亞病毒顆粒(infectious subvirionparticles, ISVPs)極為相似的顆粒。然后病毒顆粒從胞內小泡穿過細胞膜進入宿主細胞。穿膜過程主要由外層衣殼蛋白 μ1 起作用。該蛋白在病毒顆粒成熟階段就切割成兩部分，其中的 μ1N 釋放出的疏水肽段在病毒顆粒的跨膜機制中起到重要作用。這種穿膜方式也是許多無包膜病毒穿膜的主要機制。穿入胞漿時，呼腸病毒核心（the reoviral core）保持完整狀態(tài)。呼腸病毒核心是病毒顆粒的內部結構，它含有基因組全部十個片段，并組織它們合成、修飾、輸出病毒 mRNA。一旦進入胞漿后，具有轉錄活性的病毒顆粒會解聚，同時合成正鏈 RNA 用來當作新的病毒蛋白翻譯的模板 mRNA 或合成雙鏈病毒基因組 RNA。mRNA 最終到達宿主細胞核糖體，在那里根據 mRNA合成病毒蛋白。
呼腸病毒在體外可誘導多種細胞系凋亡。推測凋亡的發(fā)生可能不經過病毒顆粒復制的完整周期，而是與病毒結構蛋白 μ1 和 σ1 的誘導密切相關。呼腸病毒誘導的細胞凋亡通路涉及死亡受體介導的胞外信號通路和線粒體途徑的胞內信號通路[19，20]。通過死亡受體介導的凋亡起始于受體和配體復合物的形成，這一過程中受體寡聚化，產生死亡信號并讓起始胱冬酶（Caspase-8）活化，活化的 Caspase-8 將死亡信號進一步傳遞下去。線粒體凋亡途徑則需要特殊信號的參與，使前凋亡分子（包括細胞色素 c）從內膜系統(tǒng)釋放出來[21]。死亡受體的活化與線粒體凋亡途徑不是相互排斥的，它們在許多層次上相互交叉[22]。呼腸病毒感染細胞后的早期事件決定細胞凋亡的發(fā)生，對這兩個蛋白誘導細胞凋亡功能的認識將對了解凋亡起始的早期事件（proapoptotic initiation）非常關鍵。本研究將對新型呼腸病毒 BYD1 株的 σ1 蛋白和 μ1 蛋白誘導細胞凋亡的能力進行研究，為闡明 BYD1 株病毒誘導細胞凋亡的分子機制奠定基礎。

另外研究發(fā)現，呼腸病毒感染造成動物中樞神經系統(tǒng)和心臟病變。盡管已有報道指出呼腸病毒感染造成的組織損傷與其誘導的細胞凋亡有密切聯系，但仍缺乏呼腸病毒誘導的細胞凋亡導致動物器官病變的直接證據。為了研究新型呼腸病毒 BYD1 株誘導的細胞凋亡與致病性的關系，我們將BYD1 病毒注射乳鼠，通過對感染乳鼠的表征觀察、組織病理觀察和組織原位凋亡分析，探討呼腸病毒誘導的凋亡在組織損傷中的作用。

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第一部分 新型呼腸病毒 BYD1 株誘導細胞凋亡的分子機制的初步研究

第一章 BYD1 株病毒誘導細胞凋亡能力研究
誘導細胞凋亡是許多病毒重要的致病機制。已知某些哺乳動物呼腸病毒可以在體外誘導多種細胞凋亡[11，12，13]。BYD1 株病毒為本實驗室從 SARS患者標本中分離得到的新型呼腸病毒，本章研究主要探討其是否具有誘導細胞凋亡能力。我們首先對 BYD1 株病毒進行毒力滴定，然后用不同滴度 BYD1 株病毒感染 HeLa 細胞檢測細胞凋亡率。凋亡的檢測采用碘化丙啶（PI）和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的 Ca2+依賴性磷脂結合蛋白（Annexin-V）對細胞染色，然后經流式細胞儀檢測得到細胞凋亡率。Annexin-V 是一種分子量為35-36KD 的蛋白，能與細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異性結合。PS 正常位于細胞膜的內側，在細胞凋亡早期它外翻到細胞膜表面，暴露在細胞外環(huán)境中。在凋亡中晚期，細胞膜結構被破壞，PI 能進入細胞使細胞核紅染。流式細胞儀通過對熒光信號的檢測來反映細胞凋亡的情況。通過對細胞凋亡率的統(tǒng)計分析，判斷病毒是否顯著誘導細胞凋亡。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株
新型呼腸病毒 BYD1 株為本實驗室 2003 年從 SARS 確診患者咽拭子標本中分離、經 2 次空斑純化后保存。
1.1.2 細胞
人成纖維細胞，HeLa，本室保存；
小鼠成纖維細胞，L929，本室保存；
1.1.3 主要培養(yǎng)基和液體
（1）D-MEM 培養(yǎng)基

取少于總體積 5%的去離子水，在室溫（15～30℃）融化固體培養(yǎng)基，溫和攪拌。每升培養(yǎng)基加 3.7 克 NaHCO3。攪拌使完全溶解。用 1N 的 NaOH或 HCl 將 pH 值調到比所需的最終小 0.2～0.3 個 pH 值。加水至終體積，開始過濾。

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第二章 新型呼腸病毒BYD1 株結構蛋白σ1 和μ1 基因重組質粒的構建和表達
σ1 蛋白是呼腸病毒結構蛋白，呈纖維狀，共 36 個，以同型三聚體形式位于病毒二十面體外殼的 12 個頂角，也稱為黏附蛋白。目前確切知道的是病毒通過 σ1 蛋白結合細胞表面受體和細胞表面糖類分子來介導病毒入侵細胞。σ1 蛋白除了影響病毒的組織親嗜性，感染后的親噬路徑（route of spread）以及致病性外[Barton ES ， 2001]，還成為影響病毒誘導細胞凋亡的因素之一。σ1蛋白呈纖維狀，其球狀頭部有兩個獨立的細胞表面受體結合區(qū)域，分別為連接粘附分子（junction adhesion molecule, JAM）結合域和唾液酸分子（α-linked sialic acid, SA）結合域[25]，，不是所有毒株都同時具備這兩個結合域，而且不同毒株的這兩個結構域的分布和結構不同。σ1 蛋白結構上的差異影響病毒誘導細胞凋亡的能力[11，24，25]。σ1 蛋白是否單獨具有誘導細胞凋亡的能力還有爭議。因此，關于 σ1 蛋白誘導細胞凋亡的認識還不清楚，凋亡起始的機制依然未知[Kominsky DJ，2002]。由于 BYD1 株病毒 σ1 蛋白氨基酸序列與所有已知呼腸病毒的同源性都很低，最高為 64%[18]，所以我們選取全長 σ1 蛋白來研究其誘導細胞凋亡的能力。

μ1 蛋白是呼腸病毒的又一個結構蛋白。600 個 μ1 蛋白以同型三聚體形式構成呼腸病毒外層衣殼網格（outer capsid latice）的主體，μ1 蛋白是病毒顆粒的穿膜蛋白。μ1 蛋白與 σ3 蛋白緊密聯結，受到 σ3 蛋白的保護。2006 年 Danthi 發(fā)現呼腸病毒經抗 σ1 單抗處理后，感染只有 Fc 受體而沒有 JAM 和 SA 受體分子的 CHO 細胞，結果仍導致細胞凋亡。說明在病毒誘導細胞凋亡過程中 σ1 蛋白并非必須[26]。同年，Coffey 等人發(fā)現 1 型呼腸病毒 T1L 株的 μ1 蛋白單獨即可誘導細胞凋亡，這也是迄今為止僅有的一篇關于 μ1 蛋白誘導細胞凋亡的報道[23]。呼腸病毒 μ1 蛋白在體內被不同方式切割為三個主要的區(qū)域，分別為：①μ1N 末端區(qū)，為 2-41 氨基酸殘基部分。這一片段在大部分 μ1 蛋白合成后被自我催化切割掉。②中心片段區(qū) δ，為 42 -581 氨基酸殘基；③C-末端區(qū) φ，為 582 – 708 氨基酸殘基（見圖 1-2）[27]。Coffey 發(fā)現，除 μ1N 末端區(qū)外，其它片段均不同程度地誘導 CHO 細胞及 CV-1 細胞凋亡。尤其 μ1(1-675)片段誘導細胞凋亡能力最強[23]。μ1(1-675)片段包含 μ1N 末端區(qū)、δ 區(qū)以及 φ區(qū)的一個 α 螺旋。本研究選取全長 μ1 蛋白、μ1 蛋白的 φ 片段以及 μ1(1-675)片段。所選的 3 個蛋白片段包涵了 μ1 蛋白 3 個主要的存在形式。

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第一部分 新型呼腸病毒BYD1株誘導細胞凋亡的分子機制的初步研究...............9
第一章 BYD1株病毒誘導細胞凋亡能力研究........................................9
第二章 新型呼腸病毒BYD1株結構蛋白σ1和μ1基因重組質粒的構建和表達..........15
第三章 新型呼腸病毒BYD1株結構蛋白σ1和μ1誘導細胞凋亡的功能研究..........30

第二部分 新型呼腸病毒BYD1株誘導細胞凋亡與致病性關系研究....................41

第二部分 新型呼腸病毒 BYD1 株誘導細胞凋亡與致病性關系研究

Goody RJ 等人發(fā)現，注射大劑量（5×106PFU）III 型呼腸病毒 T3A 或者 T3D，能夠導致 90% 的 1 日齡乳鼠出現急性松弛性癱瘓[35]。DeBiasi 等人研究指出，抑制 III 型呼腸病毒誘導的細胞凋亡可以顯著減輕因呼腸病毒感染造成的新生小鼠心肌炎[36]。因此認為呼腸病毒感染造成的組織損傷與其誘導的細胞凋亡有密切聯系。為了認識新型呼腸病毒 BYD1 株誘導細胞凋亡與致病性之間的關系，我們將 BYD1 株病毒經顱腔注射乳鼠，通過對感染乳鼠的表征觀察、臟器病理觀察和組織原位凋亡檢測來研究 BYD1 株病毒感染所造成的組織損傷，以及損傷與細胞凋亡間的關系。

1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株與細胞株
新型呼腸病毒 BYD1 株，本實驗室保存。
1.1.2 實驗動物
昆明種乳鼠，2 日齡內，SPF 級，軍事醫(yī)學科學院動物中心生產。
1.3 實驗方法
1.3.1 BYD1 株病毒感染乳鼠
取 2 日齡昆明種乳鼠 5 只，用 1ml 一次性注射器經顱腔注射病毒感染乳鼠，注射位置在乳鼠眼耳連線中間，每只乳鼠注射 BYD1 株病毒原液 20μl，注射之后放回籠中與母鼠一同飼養(yǎng)，乳鼠感染后逐日觀察發(fā)病情況并記錄。另設對照組乳鼠 5 只，每只注射滅菌生理鹽水 20μl。
1.3.2 感染乳鼠臟器損傷的病理學分析

感染病毒后第 8 天處死全部乳鼠，取腦、心、肺和腎，浸入 10%福爾馬林固定液（用新鮮配制的 PBS 稀釋）。固定超過 24h，送交本所病理室制成石蠟切片。對組織切片進行 HE 染色后由本院二所進行病理分析并拍照記錄。

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結 論

BYD1 株病毒對乳鼠的致病性實驗證實，病毒感染會造成動物全身多個器官病變。就我們所觀察的腦、心、肺和腎等臟器組織全部出現了不同程度的病理變化。其中中樞神經的損傷主要集中在大腦皮質和海馬組織。感染乳鼠的丘腦僅見個別神經細胞核濃縮深染，血管周圍間隙輕度增寬，余未見其它明顯異常。推測 BYD1 株病毒對大腦皮質和海馬組織親嗜性較強。有報道指出病毒感染導致的病毒性心肌炎是非遺傳性心臟病的一個主要病因[Barton ES，2001]。BYD1 株病毒感染造成乳鼠心肌組織損傷，同時出現單核細胞、淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，為心肌炎癥狀。

感染乳鼠的肺組織病變嚴重，除明顯的組織病變外，伴隨有典型的炎性細胞的出現。說明 BYD1 株病毒的感染導致動物出現肺炎。BYD1 株病毒感染乳鼠的腎臟部分近曲小管上皮細胞輕度腫脹；皮髓質交界區(qū)可見小片狀腎小管結構消失，代之纖維組織增生。除此，腎臟組織無其他異常。新型呼腸病毒 BYD1 株的感染導致動物中樞神經損傷，以及心肌炎和肺炎的發(fā)生。

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參考文獻（略）

本文編號：313717