發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 15:52

前 言

呼腸病毒顆粒為無(wú)包膜的二十面體結(jié)構(gòu)。其外層衣殼網(wǎng)格（outer capsidlatice）的主體由 600 個(gè) μ1 蛋白以三聚體形式構(gòu)成。μ1 蛋白是病毒顆粒的穿膜蛋白，它與 σ3 緊密聯(lián)結(jié)，并受到 σ3 蛋白的保護(hù)。σ3 蛋白也一同構(gòu)成病毒衣殼。σ1 蛋白是病毒黏附蛋白（attachment protein），呈纖維狀，共36 個(gè)，它們以三聚體形式位于毒粒外衣殼的 12 個(gè)頂角上，介導(dǎo)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。呼腸病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染首先以黏附蛋白 σ1 結(jié)合細(xì)胞受體開(kāi)始，然后病毒顆粒以酷似受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞,形成胞內(nèi)小泡（endocyticvesicles）。在胞內(nèi)小泡中產(chǎn)生了與感染性亞病毒顆粒(infectious subvirionparticles, ISVPs)極為相似的顆粒。然后病毒顆粒從胞內(nèi)小泡穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入宿主細(xì)胞。穿膜過(guò)程主要由外層衣殼蛋白 μ1 起作用。該蛋白在病毒顆粒成熟階段就切割成兩部分，其中的 μ1N 釋放出的疏水肽段在病毒顆粒的跨膜機(jī)制中起到重要作用。這種穿膜方式也是許多無(wú)包膜病毒穿膜的主要機(jī)制。穿入胞漿時(shí)，呼腸病毒核心（the reoviral core）保持完整狀態(tài)。呼腸病毒核心是病毒顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，它含有基因組全部十個(gè)片段，并組織它們合成、修飾、輸出病毒 mRNA。一旦進(jìn)入胞漿后，具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒顆粒會(huì)解聚，同時(shí)合成正鏈 RNA 用來(lái)當(dāng)作新的病毒蛋白翻譯的模板 mRNA 或合成雙鏈病毒基因組 RNA。mRNA 最終到達(dá)宿主細(xì)胞核糖體，在那里根據(jù) mRNA合成病毒蛋白。
呼腸病毒在體外可誘導(dǎo)多種細(xì)胞系凋亡。推測(cè)凋亡的發(fā)生可能不經(jīng)過(guò)病毒顆粒復(fù)制的完整周期，而是與病毒結(jié)構(gòu)蛋白 μ1 和 σ1 的誘導(dǎo)密切相關(guān)。呼腸病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路涉及死亡受體介導(dǎo)的胞外信號(hào)通路和線粒體途徑的胞內(nèi)信號(hào)通路[19，20]。通過(guò)死亡受體介導(dǎo)的凋亡起始于受體和配體復(fù)合物的形成，這一過(guò)程中受體寡聚化，產(chǎn)生死亡信號(hào)并讓起始胱冬酶（Caspase-8）活化，活化的 Caspase-8 將死亡信號(hào)進(jìn)一步傳遞下去。線粒體凋亡途徑則需要特殊信號(hào)的參與，使前凋亡分子（包括細(xì)胞色素 c）從內(nèi)膜系統(tǒng)釋放出來(lái)[21]。死亡受體的活化與線粒體凋亡途徑不是相互排斥的，它們?cè)谠S多層次上相互交叉[22]。呼腸病毒感染細(xì)胞后的早期事件決定細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)這兩個(gè)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的認(rèn)識(shí)將對(duì)了解凋亡起始的早期事件（proapoptotic initiation）非常關(guān)鍵。本研究將對(duì)新型呼腸病毒 BYD1 株的 σ1 蛋白和 μ1 蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力進(jìn)行研究，為闡明 BYD1 株病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

另外研究發(fā)現(xiàn)，呼腸病毒感染造成動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟病變。盡管已有報(bào)道指出呼腸病毒感染造成的組織損傷與其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系，但仍缺乏呼腸病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致動(dòng)物器官病變的直接證據(jù)。為了研究新型呼腸病毒 BYD1 株誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與致病性的關(guān)系，我們將BYD1 病毒注射乳鼠，通過(guò)對(duì)感染乳鼠的表征觀察、組織病理觀察和組織原位凋亡分析，探討呼腸病毒誘導(dǎo)的凋亡在組織損傷中的作用。

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第一部分 新型呼腸病毒 BYD1 株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的初步研究

第一章 BYD1 株病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力研究
誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是許多病毒重要的致病機(jī)制。已知某些哺乳動(dòng)物呼腸病毒可以在體外誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡[11，12，13]。BYD1 株病毒為本實(shí)驗(yàn)室從 SARS患者標(biāo)本中分離得到的新型呼腸病毒，本章研究主要探討其是否具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力。我們首先對(duì) BYD1 株病毒進(jìn)行毒力滴定，然后用不同滴度 BYD1 株病毒感染 HeLa 細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。凋亡的檢測(cè)采用碘化丙啶（PI）和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白（Annexin-V）對(duì)細(xì)胞染色，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到細(xì)胞凋亡率。Annexin-V 是一種分子量為35-36KD 的蛋白，能與細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異性結(jié)合。PS 正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡早期它外翻到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。在凋亡中晚期，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，PI 能進(jìn)入細(xì)胞使細(xì)胞核紅染。流式細(xì)胞儀通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)來(lái)反映細(xì)胞凋亡的情況。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)分析，判斷病毒是否顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株
新型呼腸病毒 BYD1 株為本實(shí)驗(yàn)室 2003 年從 SARS 確診患者咽拭子標(biāo)本中分離、經(jīng) 2 次空斑純化后保存。
1.1.2 細(xì)胞
人成纖維細(xì)胞，HeLa，本室保存；
小鼠成纖維細(xì)胞，L929，本室保存；
1.1.3 主要培養(yǎng)基和液體
（1）D-MEM 培養(yǎng)基

取少于總體積 5%的去離子水，在室溫（15～30℃）融化固體培養(yǎng)基，溫和攪拌。每升培養(yǎng)基加 3.7 克 NaHCO3。攪拌使完全溶解。用 1N 的 NaOH或 HCl 將 pH 值調(diào)到比所需的最終小 0.2～0.3 個(gè) pH 值。加水至終體積，開(kāi)始過(guò)濾。

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第二章 新型呼腸病毒BYD1 株結(jié)構(gòu)蛋白σ1 和μ1 基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)
σ1 蛋白是呼腸病毒結(jié)構(gòu)蛋白，呈纖維狀，共 36 個(gè)，以同型三聚體形式位于病毒二十面體外殼的 12 個(gè)頂角，也稱為黏附蛋白。目前確切知道的是病毒通過(guò) σ1 蛋白結(jié)合細(xì)胞表面受體和細(xì)胞表面糖類分子來(lái)介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞。σ1 蛋白除了影響病毒的組織親嗜性，感染后的親噬路徑（route of spread）以及致病性外[Barton ES ， 2001]，還成為影響病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素之一。σ1蛋白呈纖維狀，其球狀頭部有兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞表面受體結(jié)合區(qū)域，分別為連接粘附分子（junction adhesion molecule, JAM）結(jié)合域和唾液酸分子（α-linked sialic acid, SA）結(jié)合域[25]，，不是所有毒株都同時(shí)具備這兩個(gè)結(jié)合域，而且不同毒株的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的分布和結(jié)構(gòu)不同。σ1 蛋白結(jié)構(gòu)上的差異影響病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[11，24，25]。σ1 蛋白是否單獨(dú)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力還有爭(zhēng)議。因此，關(guān)于 σ1 蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)還不清楚，凋亡起始的機(jī)制依然未知[Kominsky DJ，2002]。由于 BYD1 株病毒 σ1 蛋白氨基酸序列與所有已知呼腸病毒的同源性都很低，最高為 64%[18]，所以我們選取全長(zhǎng) σ1 蛋白來(lái)研究其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

μ1 蛋白是呼腸病毒的又一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。600 個(gè) μ1 蛋白以同型三聚體形式構(gòu)成呼腸病毒外層衣殼網(wǎng)格（outer capsid latice）的主體，μ1 蛋白是病毒顆粒的穿膜蛋白。μ1 蛋白與 σ3 蛋白緊密聯(lián)結(jié)，受到 σ3 蛋白的保護(hù)。2006 年 Danthi 發(fā)現(xiàn)呼腸病毒經(jīng)抗 σ1 單抗處理后，感染只有 Fc 受體而沒(méi)有 JAM 和 SA 受體分子的 CHO 細(xì)胞，結(jié)果仍導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。說(shuō)明在病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中 σ1 蛋白并非必須[26]。同年，Coffey 等人發(fā)現(xiàn) 1 型呼腸病毒 T1L 株的 μ1 蛋白單獨(dú)即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這也是迄今為止僅有的一篇關(guān)于 μ1 蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報(bào)道[23]。呼腸病毒 μ1 蛋白在體內(nèi)被不同方式切割為三個(gè)主要的區(qū)域，分別為：①μ1N 末端區(qū)，為 2-41 氨基酸殘基部分。這一片段在大部分 μ1 蛋白合成后被自我催化切割掉。②中心片段區(qū) δ，為 42 -581 氨基酸殘基；③C-末端區(qū) φ，為 582 – 708 氨基酸殘基（見(jiàn)圖 1-2）[27]。Coffey 發(fā)現(xiàn)，除 μ1N 末端區(qū)外，其它片段均不同程度地誘導(dǎo) CHO 細(xì)胞及 CV-1 細(xì)胞凋亡。尤其 μ1(1-675)片段誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力最強(qiáng)[23]。μ1(1-675)片段包含 μ1N 末端區(qū)、δ 區(qū)以及 φ區(qū)的一個(gè) α 螺旋。本研究選取全長(zhǎng) μ1 蛋白、μ1 蛋白的 φ 片段以及 μ1(1-675)片段。所選的 3 個(gè)蛋白片段包涵了 μ1 蛋白 3 個(gè)主要的存在形式。

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第一部分 新型呼腸病毒BYD1株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的初步研究...............9
第一章 BYD1株病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力研究........................................9
第二章 新型呼腸病毒BYD1株結(jié)構(gòu)蛋白σ1和μ1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)..........15
第三章 新型呼腸病毒BYD1株結(jié)構(gòu)蛋白σ1和μ1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能研究..........30

第二部分 新型呼腸病毒BYD1株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與致病性關(guān)系研究....................41

第二部分 新型呼腸病毒 BYD1 株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與致病性關(guān)系研究

Goody RJ 等人發(fā)現(xiàn)，注射大劑量（5×106PFU）III 型呼腸病毒 T3A 或者 T3D，能夠?qū)е?90% 的 1 日齡乳鼠出現(xiàn)急性松弛性癱瘓[35]。DeBiasi 等人研究指出，抑制 III 型呼腸病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以顯著減輕因呼腸病毒感染造成的新生小鼠心肌炎[36]。因此認(rèn)為呼腸病毒感染造成的組織損傷與其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系。為了認(rèn)識(shí)新型呼腸病毒 BYD1 株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與致病性之間的關(guān)系，我們將 BYD1 株病毒經(jīng)顱腔注射乳鼠，通過(guò)對(duì)感染乳鼠的表征觀察、臟器病理觀察和組織原位凋亡檢測(cè)來(lái)研究 BYD1 株病毒感染所造成的組織損傷，以及損傷與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系。

1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株與細(xì)胞株
新型呼腸病毒 BYD1 株，本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
昆明種乳鼠，2 日齡內(nèi)，SPF 級(jí)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心生產(chǎn)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 BYD1 株病毒感染乳鼠
取 2 日齡昆明種乳鼠 5 只，用 1ml 一次性注射器經(jīng)顱腔注射病毒感染乳鼠，注射位置在乳鼠眼耳連線中間，每只乳鼠注射 BYD1 株病毒原液 20μl，注射之后放回籠中與母鼠一同飼養(yǎng)，乳鼠感染后逐日觀察發(fā)病情況并記錄。另設(shè)對(duì)照組乳鼠 5 只，每只注射滅菌生理鹽水 20μl。
1.3.2 感染乳鼠臟器損傷的病理學(xué)分析

感染病毒后第 8 天處死全部乳鼠，取腦、心、肺和腎，浸入 10%福爾馬林固定液（用新鮮配制的 PBS 稀釋）。固定超過(guò) 24h，送交本所病理室制成石蠟切片。對(duì)組織切片進(jìn)行 HE 染色后由本院二所進(jìn)行病理分析并拍照記錄。

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結(jié) 論

BYD1 株病毒對(duì)乳鼠的致病性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，病毒感染會(huì)造成動(dòng)物全身多個(gè)器官病變。就我們所觀察的腦、心、肺和腎等臟器組織全部出現(xiàn)了不同程度的病理變化。其中中樞神經(jīng)的損傷主要集中在大腦皮質(zhì)和海馬組織。感染乳鼠的丘腦僅見(jiàn)個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞核濃縮深染，血管周圍間隙輕度增寬，余未見(jiàn)其它明顯異常。推測(cè) BYD1 株病毒對(duì)大腦皮質(zhì)和海馬組織親嗜性較強(qiáng)。有報(bào)道指出病毒感染導(dǎo)致的病毒性心肌炎是非遺傳性心臟病的一個(gè)主要病因[Barton ES，2001]。BYD1 株病毒感染造成乳鼠心肌組織損傷，同時(shí)出現(xiàn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，為心肌炎癥狀。

感染乳鼠的肺組織病變嚴(yán)重，除明顯的組織病變外，伴隨有典型的炎性細(xì)胞的出現(xiàn)。說(shuō)明 BYD1 株病毒的感染導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)肺炎。BYD1 株病毒感染乳鼠的腎臟部分近曲小管上皮細(xì)胞輕度腫脹；皮髓質(zhì)交界區(qū)可見(jiàn)小片狀腎小管結(jié)構(gòu)消失，代之纖維組織增生。除此，腎臟組織無(wú)其他異常。新型呼腸病毒 BYD1 株的感染導(dǎo)致動(dòng)物中樞神經(jīng)損傷，以及心肌炎和肺炎的發(fā)生。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：313717