發(fā)布時間：2020-11-22 02:35

　　 家蠶最具特色和被人類廣泛利用的價值是高效生產絲蛋白質纖維。絲腺是家蠶高度特化的專一合成和分泌絲蛋白的器官,是人類馴化和選擇家蠶的主要對象。提高絲腺的蛋白質合成與分泌效率,改良絲腺合成的蛋白質纖維成分是養(yǎng)蠶業(yè)世界矚目的重大課題。伴隨家蠶轉基因技術的日趨成熟,有效利用絲腺超強的蛋白質合成能力生產外源蛋白,成為生物反應器研究領域熱門課題；家蠶作為中國特色的模式動物研究,在農業(yè)昆蟲的模式應用和生物醫(yī)學的無脊椎動物替代領域也備受業(yè)者關注。本文研究了一種轉基因家蠶后部絲腺突變表型與機制,主要結果如下：1.通過轉基因技術構建了家蠶后部絲腺發(fā)育突變體TBH本文設計了全長3057 bp的Fib-H相似編碼序列Hpl (Fib-H-like gene),通過Piggybac轉座子將Hpl轉入到家蠶基因組,篩選獲得了后部絲腺(PSG)特異表達Hpl的突變體TBH(hpl/hpl)。經mRNA及蛋白水平檢測,外源基因Hpl在PSG成功表達。TBH幼蟲期的前部絲腺(ASG)與中部絲腺(MSG)發(fā)育正常,而PSG長度顯著短于野生型,PSG直徑變粗且透光性降低、折疊數減少、出現大量結節(jié)“念珠”狀卷曲,且細胞核排列由野生型的樹突分支狀變得雜亂無章。TBH成熟幼蟲吐絲量減少,化蛹過程中裸蛹及半化蛹個體比例顯著增高。2.降低內源絲素基因的表達能夠提高外源重組蛋白在后部絲腺中的表達量TBH個體中,內源的Fib-L和P25基因的轉錄水平與蛋白質合成及分泌水平沒有下降,而Fib-H的：mRNA水平降低了71.1%；分泌的絲素蛋白中,Fib-H的比例從野生型的91.86%降至71.01%。外源重組基因Hpl的mRNA水平雖然分別只有Fib-H和Fib-L的0.73‰和0.74‰,而HPL蛋白占絲素蛋白和分泌蛋白總量的量高達18.85%和15.46%,非常高效地翻譯和分泌了外源大分子蛋白HPL。進一步對PSG細胞DEGs分析,檢測到891個DEGs。TBH的PSG細胞中,不僅與內質網蛋白加工相關的239個基因表達出現顯著差異,應激和細胞凋亡以及神經反應相關的37個基因也受到顯著影響。顯示TBH系統(tǒng)在Fib-H轉錄被下調的同時,非常顯著地提高了外源重組蛋白的產量。該結果對其他重組蛋白在絲腺中的生產提供了重要的參考意義及優(yōu)化思路。3.后部絲腺發(fā)育異常影響其退化過程中的程序性細胞死亡進程及30K蛋白的正常表達在幼蟲-蛹變態(tài)過程的絲腺退化期,通過對轉基因突變體TBH的絲腺HE染色和PCD相關檢測表明：TBH的絲腺在退化過程中顯著慢于野生型。PSD中30K蛋白水平檢測結果顯示,5齡幼蟲期TBH與野生型家蠶之間無明顯差異；但絲腺退化過程中,野生型家蠶在絲蛋白質合成減速后,提高了30K蛋白水平合成水平,TBH家蠶的絲腺中30K蛋白基因的轉錄水平和30K蛋白水平明顯低于野生型。推測阻遏Fib-H等絲蛋白正常表達,會導致(后部)絲腺發(fā)育畸形,并進一步改變了絲腺退化過程中的PCD與絲腺生理蛋白質合成功能的轉變,影響30K等蛋白參與的生殖發(fā)育等一系列生理功能,如導致產卵量明顯下降。4.以TBH為材料初步建立高蛋白/氨基酸血癥模型如同高血脂、高血糖對人類身體的影響,高蛋白或氨基酸血癥對人體的生命健康同樣具有嚴重的威脅,但至今還未有高蛋白/氨基酸血癥動物疾病模型的報道。本文的轉基因突變體TBH個體在蛹期血淋巴中的蛋白質及游離氨基酸濃度急劇上升,出現6d-7d的高循環(huán)血高蛋白/氨基酸環(huán)境,并誘導TBH家蠶個體死亡。這是一例窗口期長占生命周期10%以上的高蛋白/氨基酸血癥模型,提高對研究高蛋白/氨基酸血癥動物組織病變機制、開發(fā)相關治療藥物具有重要意義。而且該時期動物(家蠶)不進食與活動,是一個封閉的生物系統(tǒng),能夠顯著提高相關研究的準確性。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S881.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1 家蠶絲腺的發(fā)育與退化
        1.1 絲腺的發(fā)生與發(fā)育
        1.2 絲腺細胞的自噬與凋亡
        1.3 絲腺程序性死亡與30K蛋白合成
        1.4 絲腺程序性死亡的研究價值
    2 家蠶絲蛋白基因表達調控及表達缺陷絲腺退化模型
        2.1 絲膠蛋白的組成及其基因表達調控
        2.2 絲素蛋白的組成及其基因表達調控
        2.3 Nd裸蛹系統(tǒng)絲蛋白基因表達缺陷絲腺退化模型
        2.4 裸蛹系統(tǒng)的開發(fā)利用
    3 家蠶絲腺生物反應器研究現狀及優(yōu)化思路
        3.1 絲腺生物反應器的優(yōu)勢
        3.2 絲腺反應器的研究現狀
        3.3 絲腺生物反應器的優(yōu)化方向
    4 高蛋白/氨基酸血癥動物模型
        4.1 人類低/高蛋白血癥及其相關模型
        4.2 家蠶在生物醫(yī)藥及疾病模型研究中的地位
    5 立題依據與研究內容
    6 研究技術路線
第二章 家蠶后部絲腺轉基因突變系統(tǒng)的構建及其表型分析
    1 試驗動物
    2 試驗試劑
        2.1 主要試劑
        2.2 主要試劑的配制
        2.3 儀器設備
    3 試驗方法
        3.1 轉基因載體的構建
        3.2 胚胎的顯微注射及轉基因個體篩選
        3.3 石蠟切片的制備
        3.4 HE染色
        3.5 DAPI染色
        3.6 酚/氯仿法基因組DNA抽提
        3.7 反向PCR
        3.8 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        3.9 DNA回收、純化、測序及分析
        3.10 后部絲腺總RNA提取
        3.11 總RNA的消化
        3.12 RNA反轉錄及SqRT-PCR反應
        3.13 蛋白質的提取
        3.14 BCA法測定蛋白濃度
        3.15 Western Blot
    4 試驗結果
        4.1 外源基因Hpl的設計及轉基因突變系統(tǒng)TBH（Hpl/Hpl）的建立
        4.2 突變系統(tǒng)TBH家蠶Hpl基因表達鑒定
        4.3 TBH家蠶絲腺發(fā)育異常的表型分析
    5 討論與小結
第三章 降低家蠶內源絲蛋白表達對外源重組蛋白表達的影響
    1 試驗動物
    2 試驗試劑
    3 試驗方法
        3.1 總RNA的提取及消化
        3.2 RNA反轉錄及SqRT-PCR反應
        3.3 實時定量PCR
        3.4 轉錄組學測序（RNA-Seq）
        3.5 繭絲蛋白的提取
        3.6 BCA法測定蛋白濃度
        3.7 SDS-PAGE
        3.8 蛋白質染色
        3.9 Westem Blot
        3.10 繭絲物理性能測定
    4 試驗結果
        4.1 外源重組蛋白HPL表達效率
        4.2 TBH與野生型后部絲腺的轉錄組差異表達基因比較
        4.3 TBH繭絲的物理性能
    5 討論與小結
第四章 突變體TBH家蠶絲腺程序性細胞死亡過程中30K蛋白的表達
    1 試驗動物
    2 試驗試劑
    3 試驗方法
        3.1 石蠟切片的制作
        3.2 HE染色及DAPI染色
        3.3 活性氧檢測
        3.4 蛋白提取及濃度的測定
        3.5 Western Blot
        3.6 免疫組化
        3.7 DNA Ladder
        3.8 RNA的提取、消化、轉錄、半定量與定量PCR及電泳
    4 試驗結果
        4.1 TBH家蠶變態(tài)發(fā)育過程中絲腺退化延遲
        4.2 TBH家蠶后部絲腺退化過程中自噬與凋亡相關基因表達
        4.3 TBH家蠶后部絲腺退化過程中相關蛋白質的修飾變化
        4.4 TBH家蠶后部絲腺退化過程中30K蛋白表達分析
        4.5 TBH絲腺退化過程中的活性氧水平分析
    5 討論與小結
第五章 高蛋白/高氨基酸血癥家蠶動物模型
    1 試驗動物
    2 試驗試劑
    3 試驗方法
        3.1 死亡率統(tǒng)計方法
        3.2 血清蛋白的提取及測定方法
        3.3 血清總游離氨基酸樣品的提取方法
        3.4 氨基酸的測定方法
        3.5 Western Blot
    4 試驗結果
        4.1 TBH家蠶幼蟲吐絲及蛹期血淋巴蛋白濃度
        4.2 TBH家蠶幼蟲吐絲及蛹期血淋巴游離氨基酸含量
        4.3 TBH家蠶幼蟲吐絲及蛹期死亡率
        4.4 高血/高氨基酸血癥對TBH個體的生殖影響
    5 討論與小結
第六章 結論
    1 論文研究結論
    2 論文創(chuàng)新點
    3 后續(xù)研究展望與建議
參考文獻
會議與發(fā)表論文及申請專利
資助項目
攻讀學位期間參與項目
文中主要縮略詞表
致謝


本文編號：2893970