發(fā)布時間：2020-11-21 16:29

　　 紫花苜蓿(Medicago sativa)為豆科苜蓿屬多年生草本植物,是世界和我國最主要的優(yōu)良豆科牧草,其在發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn),改善生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著不可替代的作用。病害是苜蓿生產(chǎn)的最主要的限制因素之一,其中根腐病普遍發(fā)生、危害較大且較難防治。本研究以甘肅省環(huán)縣廣泛種植的地方品種“隴東苜�！睘檠芯坎牧�,對田間采集的病株,采用常規(guī)及分子生物學(xué)技術(shù),確定了該病病原,建立了快速檢測技術(shù),并進行了生物防治的試驗,所獲主要結(jié)果如下:1.通過對根部入侵真菌的分離、鑒定及分子生物學(xué)檢測,自苜蓿根腐病病株中分離到真菌15種,根據(jù)分離率從高到低的順序,依次為半裸鐮孢菌(Fusarium semitectum)、苜蓿莖點霉(Phoma medicaginis)、木賊鐮孢菌(F.equiseti)、細鏈格孢(Alternaria alternata)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)、短帚霉(Scopulariopsis sp.)、青霉(Penicillium sp.)、煙色織孢霉(Microdochium tabacinum)、毀滅炭疽菌(Collectotrichum destructivum)、毛殼菌(Chaetomium sp.)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、柄孢殼菌(Podospora sp.)、腔孢菌(Chaetosphaeronema sp.)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)和細極鏈格孢(A.tenuissima)。其中鐮孢菌屬真菌分離率占51.9%,為優(yōu)勢菌種,煙色織孢霉和腔孢菌為國內(nèi)苜蓿上首次發(fā)現(xiàn)。2.采用土壤接種法,測定了尖孢鐮孢菌、半裸鐮孢菌、木賊鐮孢菌、銳頂鐮孢菌、毀滅炭疽菌、苜蓿莖點霉、腔孢菌、煙色織孢霉、細極鏈格孢、細鏈格孢和柄孢殼菌等11種真菌對盆栽隴東苜蓿和白三葉草(Trifolium repens)的致病力。與不接種的對照植株相比,接種1個月后,供試真菌除柄孢殼菌外,均對苜蓿幼苗表現(xiàn)出不同程度的致病性,其中以尖孢鐮孢菌致病力最強,半裸鐮孢菌次之。發(fā)病植株根部出現(xiàn)褐色條斑,嚴重時根部腐爛,病情指數(shù)為4.4~65.4。病株地上與地下部分干重分別降低8.4%~60.3%和16.0%~59.6%,莖長與根長分別降低13.1%~52.4%和3.6%~49.6%。與不接種的對照植株相比,接種1個月后,供試真菌均對白三葉草幼苗表現(xiàn)出不同程度的致病性,其中以半裸鐮孢菌致病力最強,毀滅炭疽菌次之。植株根部出現(xiàn)褐色病斑,病情指數(shù)為3.2~32.3。除接種細鏈格孢外,病株地上與地下部分干重分別降低8.1%~65.0%和7.1%~51.8%。供試真菌對苜蓿和白三葉草的致病力隨著植株生長天數(shù)的增加而逐漸降低,對60 d株齡的危害大于90 d和120 d株齡。3.平皿法測定了我國苜蓿上首次報道的煙色織孢霉以及毀滅炭疽菌等兩種真菌的寄主范圍。煙色織孢霉的寄主除紫花苜蓿外,還有西瓜(Citrullus lanatus)、甜瓜(Cucumis melo)、黃瓜(Cucumis sativus)、南瓜(Cucurbita moschata)和西葫蘆(Cucurbita pepo),供試植株的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為70.5%~100%和33.1~91.8。毀滅炭疽菌的寄主除紫花苜蓿外,還有蘿卜(Raphanus sativus)、甘藍(Brassica oleracea)、甜椒(Capsicum annuum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)和豌豆(Pisum sativum),供試植株的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為33.3%~100%和8.3~50.4。4.建立了煙色織孢霉、半裸鐮孢菌和銳頂鐮孢菌的快速檢測技術(shù)。根據(jù)ITS rDNA序列設(shè)計了煙色織孢霉特異性引物,可從發(fā)病苜蓿根組織中直接檢測出煙色織孢霉,檢測靈敏度為20 fg/μL。根據(jù)TEF-1a基因序列,建立了半裸鐮孢菌和銳頂鐮孢菌的SYBR Green I實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測方法。該方法設(shè)計的引物特異性強,檢測靈敏度分別為35.6 fg/μL和87 fg/μL,可達到普通PCR的100倍。5.從苜蓿健株根部分離篩選出一株拮抗細菌芽孢桿菌,通過常規(guī)形態(tài)學(xué)特征、BIOLOG鑒定以及16S rDNA序列同源性分析,將該菌鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.spizizenii),采用平皿對峙法,測定了該菌株對10種苜蓿根部入侵真菌的拮抗作用,供試真菌包括尖孢鐮孢菌、半裸鐮孢菌、木賊鐮孢菌、銳頂鐮孢菌、毀滅炭疽菌、苜蓿莖點霉、煙色織孢霉、細鏈格孢、細極鏈格孢和毛殼菌。除毛殼菌外,該菌株的菌懸液對供試真菌具有很強的拮抗作用,對菌絲生長的抑制率達33.4%~90.2%,其中對細鏈格孢抑制率最強,為90.2%;毀滅炭疽菌和半裸鐮孢菌次之,抑制率分別為85.5%和84.5%。與未接種枯草芽孢桿菌的植株相比,溫室盆栽試驗中對人工接種半裸鐮孢菌引致的苜蓿根腐病防治效果達43.4%,幼苗鮮重增加37.1%。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S435.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
第二章 文獻綜述
    2.1 紫花苜蓿概述
    2.2 紫花苜蓿根腐病的研究進展
        2.2.1 紫花苜蓿根腐病的危害
        2.2.2 紫花苜蓿根腐病病原種類
        2.2.3 紫花苜蓿根腐病的防治措施
    2.3 植物真菌病害分子生物學(xué)檢測技術(shù)的研究進展
    2.4 紫花苜蓿真菌病害的生物防治
    2.5 煙色織孢霉Microdochium tabacinum的研究概況
        2.5.1 煙色織孢霉國外研究概況
        2.5.2 煙色織孢霉國內(nèi)研究概況
第三章 紫花苜蓿根腐病的病原鑒定
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試驗地概況
        3.2.2 根部入侵真菌的分離與純化
        3.2.3 根部入侵真菌的形態(tài)學(xué)鑒定
        3.2.4 根部入侵真菌的分子生物學(xué)鑒定
        3.2.5 分離真菌菌株致病性測定
        3.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 根部入侵真菌的菌種及其分離率
        3.3.2 根部入侵真菌的形態(tài)特征
        3.3.3 根部入侵真菌的分子特征
        3.3.4 所獲菌株的致病性
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 3種病原真菌分子檢測方法的建立
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
        4.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 煙色織孢霉PCR檢測體系的建立
        4.3.2 半裸鐮孢菌和銳頂鐮孢菌Real-time PCR檢測體系的建立
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 枯草芽孢桿菌MB29的篩選、鑒定和防效的研究
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
        5.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 MB29菌株的獲得與鑒定
        5.3.2 枯草芽孢桿菌MB29對苜蓿根部入侵真菌的抑制作用
        5.3.3 枯草芽孢桿菌MB29對盆栽苜蓿根腐病的防效
        5.3.4 枯草芽孢桿菌MB29對盆栽苜蓿的促生作用
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 總結(jié)與建議
    6.1 總結(jié)
    6.2 建議
參考文獻
在學(xué)期間的研究成果
致謝


本文編號：2893283