近些年來,隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,奶牛的單產(chǎn)水平逐年提升。然而隨之也帶來了很多問題,其中奶牛產(chǎn)后繁殖力下降最為突出。很多高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后出現(xiàn)不發(fā)情、發(fā)情表現(xiàn)不足或受胎率下降等情況,導(dǎo)致高產(chǎn)牛群后代數(shù)量下降,奶牛胎間距增大,養(yǎng)殖企業(yè)成本增加利潤下降。生殖激素對于調(diào)節(jié)奶牛發(fā)情周期和妊娠具有非常重要的作用,并且一直以來對其調(diào)節(jié)機制進行了大量研究和應(yīng)用,但是盡管如此也沒有從根本上解決奶牛產(chǎn)后繁殖力下降的問題。奶牛在產(chǎn)后30天開始進入產(chǎn)奶高峰期,而直到產(chǎn)后90天奶牛才開始進入采食高峰期,這一段時期奶牛的能量就處于能量負(fù)平衡狀態(tài)。然而奶牛產(chǎn)后60至90天正是參配的最佳時期。有研究發(fā)現(xiàn),奶牛在泌乳期或營養(yǎng)不足的情況下,steroidogenic acute regulatory protein(St AR)基因的表達被下調(diào)。該基因被下調(diào)將直接導(dǎo)致卵巢孕酮合成水平下降,如果奶牛此時參配則將導(dǎo)致受胎率下降。這一研究結(jié)果提示,某些營養(yǎng)物質(zhì)可能參與了奶牛產(chǎn)后發(fā)情和受孕的調(diào)節(jié)。低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)一直以來被視為營養(yǎng)物質(zhì)或類固醇激素合成底物。越來越多的研究證實低密度脂蛋白對孕酮合成具有刺激作用。而低密度脂蛋白調(diào)節(jié)St AR基因表達的證據(jù)僅在小鼠的非卵巢細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。然而在顆粒細(xì)胞中低密度脂蛋白是否具有類似的調(diào)節(jié)St AR基因表達的作用仍未有報道。而對這一問題的研究將有助于理解體內(nèi)卵泡排卵后,低密度脂蛋白在顆粒細(xì)胞向黃體細(xì)胞分化過程中對其功能轉(zhuǎn)變的作用。本研究在體外培養(yǎng)牛顆粒細(xì)胞,利用含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)液處理顆粒細(xì)胞24h后與對照組(未添加低密度脂蛋白)進行比較。利用孕酮放免試劑盒分析兩組培養(yǎng)液中的孕酮含量,結(jié)果顯示低密度脂蛋白組產(chǎn)生的孕酮(155.61±35 ng/105細(xì)胞)明顯多于對照組(30.31±6.2ng/105細(xì)胞;p0.05);熒光定量PCR結(jié)果顯示,低密度脂蛋白上調(diào)了顆粒細(xì)胞St AR和P450scc的m RNA表達量,分別比對照組提高2.29和2.33倍(p0.05);利用Western blot技術(shù)分析結(jié)果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理后,顆粒細(xì)胞中St AR蛋白表達水平較未經(jīng)處理的對照組顆粒細(xì)胞提高2.71倍(p0.05);利用油紅對兩組顆粒細(xì)胞進行染色,結(jié)果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理的顆粒細(xì)胞中積累的脂滴數(shù)量為124.3±24.3/細(xì)胞,明顯多于未經(jīng)處理的對照組中的脂滴數(shù)量(40.6±12/細(xì)胞;p0.01);另外,本實驗將奶牛發(fā)情中期黃體內(nèi)的黃體細(xì)胞(luteal cells,LC)分離出來并原代培養(yǎng)后,使用油紅染色并與前兩組進行對比,結(jié)果顯示黃體細(xì)胞中脂滴數(shù)量(354.1±27.9/細(xì)胞,p0.01)明顯多于顆粒細(xì)胞的對照組和低密度脂蛋白處理組;為了研究溶酶體在這個過程中的變化,我們分別使用了LAMP1免疫熒光染色和吖啶橙活體染色對兩組細(xì)胞中溶酶體形態(tài)進行分析,結(jié)果顯示LAMP1免疫熒光染色后低密度脂蛋白處理組中的LAMP1熒光強度(0.93±0.02)明顯高于對照組(0.57±0.14;p0.05),同樣地,吖啶橙(acridine orange,AO)染色也顯示低密度脂蛋白處理組中的溶酶體數(shù)量(58.2±5.5/細(xì)胞)明顯多于對照組(25.4±3.0/細(xì)胞;p0.05);另外,本實驗還對奶牛發(fā)情中期黃體中分離得到的黃體細(xì)胞在原代培養(yǎng)后,進行LAMP1免疫熒光染色和吖啶橙活體染色,并與前兩組進行對比,結(jié)果顯示黃體細(xì)胞中存在著大量的溶酶體,而其無論是LAMP1熒光強度(3.71±0.05)還是吖啶橙活體染色的溶酶體數(shù)量(301.7±5.0/細(xì)胞),均高于或多于(p0.05)對照組和低密度脂蛋白處理組的顆粒細(xì)胞。為了研究溶酶體在低密度脂蛋白誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞St AR表達和孕酮合成過程的作用,本實驗將培養(yǎng)的細(xì)胞分成三組,即對照組、低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)處理組和低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)與氯喹(chloroquine,CQ)(50μmol/L)混合處理組。孕酮檢測結(jié)果顯示,添加低密度脂蛋白和氯喹處理的顆粒細(xì)胞所產(chǎn)生的孕酮量(19.2±7.5ng/105細(xì)胞)與對照組(27±4.7ng/105細(xì)胞)無明顯差異(p0.05),但是這兩組明顯少于只添加低密度脂蛋白處理的顆粒細(xì)胞所產(chǎn)生的孕酮量(178.5±9.4ng/105細(xì)胞;p0.05);同時,Western blot結(jié)果表明當(dāng)氯喹被添加到培養(yǎng)液中時,低密度脂蛋白對顆粒細(xì)胞St AR蛋白質(zhì)表達的刺激作用受到了明顯抑制,即其表達水平明顯低于單獨添加低密度脂蛋白組(p0.05),而與對照組處于相似水平(p0.05)。另外,為了研究細(xì)胞內(nèi)膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)對溶酶體數(shù)量的影響,本實驗將培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞分成兩組細(xì)胞,向其添加含有60μmol/L膽固醇(Cholesterol)的培養(yǎng)液預(yù)處理顆粒細(xì)胞1小時,然后分別更換只含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)以及含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)和膽固醇(60μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。LAMP1免疫熒光分析顯示,與單獨添加低密度脂蛋白組的LAMP1的平均熒光密度(0.93±0.02)相比,添加膽固醇和低密度脂蛋白組的LAMP1平均熒光密度(0.39±0.01;p0.05)明顯減少;同樣地,吖啶橙活體染色結(jié)果顯示,膽固醇阻止了低密度脂蛋白刺激的溶酶體增多,添加膽固醇和低密度脂蛋白組顆粒細(xì)胞中的溶酶體平均數(shù)量(34.9±4.29/細(xì)胞)明顯少于單獨添加低密度脂蛋白組(75±8.25/細(xì)胞;p0.05)。因此,我們的結(jié)果表明,低密度脂蛋白通過上調(diào)牛顆粒細(xì)胞中St AR的mRNA和蛋白質(zhì)表達以及P450scc的m RNA表達方式,調(diào)控其孕酮合成水平;低密度脂蛋白刺激牛顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生大量溶酶體,并且這些溶酶體控制著低密度脂蛋白對顆粒細(xì)胞St AR蛋白質(zhì)表達和孕酮合成的調(diào)控作用,而這種溶酶體數(shù)量的變化受到了顆粒細(xì)胞中膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S823
【文章目錄】：摘要
英文摘要
1 前言
1.1 孕酮對生殖的作用與生物合成
1.1.1 孕酮對生殖的作用
1.1.2 孕酮的生物合成
1.2 黃體合成孕酮的調(diào)控因素
1.2.1 垂體激素的慢性調(diào)節(jié)
1.2.2 LH的脈沖式釋放
1.2.3 雌激素的影響
1.2.4 孕酮分泌的急性調(diào)節(jié)
1.3 StAR表達調(diào)控的研究進展
1.3.1 StAR表達的激素調(diào)節(jié)
1.3.2 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)
1.3.3 bZIP轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)
1.3.4 cAMP-PKA依賴的轉(zhuǎn)錄激活
1.3.5 StAR表達的轉(zhuǎn)錄抑制
1.4 低密度脂蛋白的攝入與代謝
1.4.1 低密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)
1.4.2 低密度脂蛋白的攝入
1.4.3 低密度脂蛋白的代謝
1.5 溶酶體的形成
1.6 研究的目的和意義
2 材料與方法
2.1 實驗試劑和儀器
2.1.1 主要試驗試劑
2.1.2 主要試驗儀器
2.2 實驗方法
2.2.1 牛顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)
2.2.2 牛顆粒細(xì)胞的處理
2.2.3 黃體細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
2.2.4 孕酮濃度測定
2.2.5 實時熒光定量PCR
2.2.6 蛋白印跡檢測
2.2.7 油紅O染色
2.2.8 吖啶橙活細(xì)胞染色
2.2.9 免疫熒光染色
2.2.10 統(tǒng)計分析
3 結(jié)果
3.1 低密度脂蛋白對牛顆粒細(xì)胞孕酮合成和St AR表達的影響
3.2 低密度脂蛋白對牛顆粒細(xì)胞中脂滴的影響
3.3 低密度脂蛋白對牛顆粒細(xì)胞中溶酶體的影響
3.4 溶酶體對低密度脂蛋白誘導(dǎo)的牛顆粒細(xì)胞St AR蛋白表達和孕酮合成的影響
3.5 膽固醇對低密度脂蛋白誘導(dǎo)的牛顆粒細(xì)胞溶酶體變化的影響
4 討論
4.1 低密度脂蛋白促進孕酮合成
4.2 溶酶體與孕酮合成的關(guān)系
4.3 顆粒細(xì)胞的膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)
4.4 總結(jié)
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
【相似文獻】
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本文編號：
2883525
