卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因(CI-MGT)具有操作簡單、胚胎損傷小和胚胎體外停留時間短等優(yōu)點,結(jié)合體內(nèi)受精胚胎和高效基因編輯技術(shù),最近被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中。單精子胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因(ICSI-MGT)適于大片段外源基因轉(zhuǎn)移,并能有效解決豬體外受精胚胎多精子受精等問題,特別適用于轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)。廣西地處高溫高濕的亞熱帶地區(qū),為優(yōu)化此種環(huán)境下豬胚胎和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,本研究在優(yōu)化豬卵母細胞體外成熟、激活及胚胎培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)探討了體外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相關(guān)影響因素,并對CI-MGT體外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬可行性進行了研究。研究結(jié)果如下：1.探討了成熟液和胚胎培養(yǎng)液組分對豬卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育效果的影響。結(jié)果顯示,成熟基礎(chǔ)液為TCM-199核成熟率和胚胎發(fā)育效率顯著高于NCSU-37和PZM-3(P0.05)。以TCM-199為成熟基礎(chǔ)液,不加額外能量底物(PMt)的核成熟率和孤雌囊胚發(fā)育率分別為74.1土2.4%和29.3+1.3%,顯著高于添加0.91 mmol/L丙酮酸鈉+3.05 mmol/L葡萄糖(PMtsg)或0.91 mmol/L丙酮酸鈉+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺(PMtsgg, P0.05)。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG組的核成熟率和胚胎發(fā)育效率顯著高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I組囊胚率顯著高于添加10 ng/mL EGF和不添加組(P0.05)。對豬卵母細胞體外成熟過程中核相變化研究顯示,成熟培養(yǎng)38 h的核成熟率為57%(105/184),40 h為43%(82/189),42 h為48%(75/155),44 h為59%(208/354),46 h為70%(59/84),48 h為62%(51/82),50 h為74%(154/207)。在以PZM-3為基礎(chǔ)液的胚胎培養(yǎng)液中添加0.277 mmol/L肌醇(PZMi),其囊胚率顯著高于添加0.34 mmol/L檸檬酸鈉(PZMc)或0.34 mmol/L檸檬酸鈉+0.277 mmol/L肌醇(PZMci, P0.05);添加0.5 mg/mL透明質(zhì)酸組的囊胚率顯著高于未添加組(P0.05)；添加3 mg/mL BSA-FAF組的囊胚率顯著高于添加BSA-V組(41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P0.05)。培養(yǎng)液中BSA濃度增加至5 mg/mL或在培養(yǎng)96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差異不顯著。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚細胞數(shù)高于未添加組,但差異不顯著。2.探討了激活方法對豬卵母細胞孤雌胚胎發(fā)育效果的影響。結(jié)果顯示,卵母細胞經(jīng)5 μmol/L離子霉素(Ion)激活5 min后,再分別在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP),5μg/mL細胞松弛素B (CB)+10放線菌酮(CHX),5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培養(yǎng)4 h的囊胚率顯著高于在10μg/mL CHX培養(yǎng)4 h的囊胚率(29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P0.05),但四組間囊胚率、ICM細胞數(shù)、TE細胞數(shù)及ICM/TE均無顯著差異。當電脈電壓為1.25KV/cm時3次電脈沖電激活的囊胚發(fā)育率顯著高于2次電脈沖(P0.05),當電脈沖為3次時電場強度為0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率顯著低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm組的囊胚率顯著高于0.80和1.20 KV/cm組(P0.05)。卵母細胞電激活后分別用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培養(yǎng)處理4 h的囊胚率(55.4±1.2%和50.4±2.9%)顯著高于用2 mmol/L 6-DMAP (37.9±2.4%),5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP (36.9±3.1%)培養(yǎng)處理4 h的囊胚發(fā)育率,亦顯著高于單純電激活處理(40.7±1.7%)和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP (30.6±0.8%)培養(yǎng)處理4 h的囊胚發(fā)育率(P0.05。電激活后,用5μg/mLCB培養(yǎng)處理4 h的囊胚率顯著高于用5μg/mLCB培養(yǎng)處理4 h(54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P0.05),與7.5μg/mLCB組差異不顯著,但7.5μg/mLCB組的ICM細胞數(shù)和ICM/TE均顯著高于5 μg/mLCB組(P0.05)。對胚胎核型進行分析結(jié)果表明,電激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培養(yǎng)處理4 h的囊胚細胞二倍體率顯著高于單純電激活處理組(84.6% vs 40.0%,P0.05)。3.研究了豬卵胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因的影響因素。孤雌激活卵胞質(zhì)注射(PA-CI)的研究結(jié)果顯示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制劑對孤雌激活卵的囊胚率、ICM細胞數(shù)、TE細胞數(shù)及ICM/TE均無顯著影響,表明可同時注射外源RNA和RNA酶抑制劑。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚陽性率顯著高于50 ng/μL和空注組,但囊胚率顯著低于其余兩組(33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P0.05)；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率與50 ng/μL注射組和空注組差異不顯著,表明注射DNA對胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均顯著低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率(P0.05)。注射EGFP-N1線性化DNA的囊胚陽性率顯著高于環(huán)狀DNA(15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P0.05),但兩者胚胎發(fā)育率差異不顯著,并且外源RNA注射組的囊胚率普遍高于注射DNA載體。當采用體外受精卵進行胞質(zhì)內(nèi)注射時(IVF-CI),精卵孵育后5-18 h注射線性化EGFP-N1載體的囊胚率和囊胚細胞數(shù)差異均不顯著,但5-6、8-9和11-12 h注射組胚胎陽性率顯著高于14-15和17-18 h(12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P0.05),表明外源DNA在豬雌雄原核形成期(約13 h)前注射的外源基因整合效率較高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA組囊胚率顯著高于100 ng/μL,與10、20、30ng/μL和空注組差異不顯著,同時40、50和100 ng/pL組陽性率顯著高于其余各組(P0.05)。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率顯著低于PA卵(13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P0.05),但注射IVF卵的胚胎基因突變效率顯著高于注射PA卵(25.0% vs3.8%,P0.05),表明Cas9/sgRNA系統(tǒng)可以通過注射豬IVF卵對豬的基因組進行編輯。4.系統(tǒng)研究了豬單精子胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因的影響因素。結(jié)果顯示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA與精子共孵育的囊胚率顯著高于50和100 ng/μL(33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P0.05),但20ng/μL孵育組胚胎陽性率顯著高于10ng/μL(30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P0.05)。精子與外源基因孵育5、30和60 min囊胚率顯著高于孵育24 h,但30和60 min組陽性率和囊胚陽性率顯著高于5 min(P0.05)。采用不同冷凍液(DPBS、 BTS和mNIM)冷凍精子對ICSI-MGT胚胎發(fā)育率無顯著影響,但精子孵育液DPBS+EDTA (10 mmol/L EDTA)的囊胚率顯著高于DPBS(27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P0.05), mNIM (10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl)組的囊胚率顯著高于DPBS+EDTA組(33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P0.05),表明孵育液中的EDTA和K+對注射后的胚胎發(fā)育有影響。精子超聲+凍融處理和NaOH處理的囊胚率顯著高于鮮精、A23187、超聲、凍融和三次凍融處理組,超聲+凍融和NaOH處理組的胚胎外源基因陽性率亦顯著高于鮮精和A23187處理組。此外,卵母細胞激活后注射超聲+凍融和NaOH處理精子的囊胚率顯著高于激活前注射組(35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P0.05),表明精子破膜與激活影響ICSI-MGT胚胎的發(fā)育。卵母細胞激活后0-30 min注射的囊胚率顯著低于60-90 min注射組,但陽性率和囊胚陽性率均顯著高于60-90 min注射組。對ICSI后不同時間合子內(nèi)的GSH含量分析顯示,激活后0-30 min注射組的6 h合子GSH含量顯著低于60-90 min注射組和孤雌激活組(3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P0.05),而60-90 min注射組的6 h和12 h合子GSH含量與孤雌組均無顯著差異。進一步原核分析發(fā)現(xiàn),0-30 min注射組的雌雄雙原核形成率顯著高于60-90 min(56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P0.05),且0-30min注射組精子解聚率顯著高于60-90min,表明延長激活以后的注射時間會造成更高的孤雌胚胎產(chǎn)生。采用不同外源基因載體(EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP)的ICSI-MGT囊胚率差異不顯著,但顯著影響胚胎陽性率,其中EGFP-N1線性化載體陽性率顯著高于環(huán)狀載體(35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P0.05),而Anti-FMDV RNAi載體陽性率和囊胚陽性率均顯著低于其它載體(P0.05)。將Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6頭自然發(fā)情受體內(nèi),4頭未見返情,其中7557號受體流產(chǎn)獲得3頭胎豬,7645號受體妊娠到期得到4頭仔豬,對仔豬耳朵皮膚EGFP和Neo雙基因進行PCR鑒定均顯示陽性,表明應(yīng)用優(yōu)化的ICSI-MGT技術(shù)可以獲得轉(zhuǎn)基因豬后代。
【學位單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S814
【文章目錄】：摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一章 文獻綜述
1 卵母細胞成熟、激活與胚胎培養(yǎng)
1.1 卵母細胞成熟
1.2 卵母細胞激活
1.3 早期胚胎發(fā)育
2 卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因
2.1 卵胞質(zhì)注射研究進展
2.2 卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因機理
2.3 卵胞質(zhì)注射影響因素
3 單精子胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因
3.1 精子載體法
3.2 單精子胞質(zhì)內(nèi)注射
4 本論文的研究意義
第二章 豬卵母細胞體外成熟與胚胎培養(yǎng)影響因素研究
摘要
前言
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.2 儀器與設(shè)備
1.3 試劑配制
1.4 試驗方法
1.5 試驗設(shè)計
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
2 試驗結(jié)果
2.1 豬卵母細胞體外成熟影響因素研究
2.2 豬胚胎培養(yǎng)影響因素研究
3 分析與討論
3.1 豬卵母細胞體外成熟影響因素研究
3.2 豬胚胎培養(yǎng)影響因素研究
4 結(jié)論
第三章 豬卵母細胞孤雌激活方法研究
摘要
前言
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.2 儀器與設(shè)備
1.3 試劑配制
1.4 試驗方法
1.5 試驗設(shè)計
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
2 試驗結(jié)果
2.1 豬卵母細胞化學激活方法的初步研究
2.2 豬卵母細胞電激活方法的初步研究
2.3 豬卵母細胞電激活聯(lián)合化學激活方法的初步研究
3 分析與討論
3.1 豬卵母細胞化學激活方法的初步研究
3.2 豬卵母細胞電激活方法的初步研究
3.3 豬卵母細胞電激活聯(lián)合化學激活方法的初步研究
4 結(jié)論
第四章 豬卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因影響因素研究
摘要
前言
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.2 儀器與設(shè)備
1.3 試劑配制
1.4 試驗方法
1.5 試驗設(shè)計
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
2 試驗結(jié)果
2.1 孤雌激活和IVF方法的完善
2.2 孤雌卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因方法的初步研究
2.3 受精卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因方法的初步研究
3 分析與討論
3.1 孤雌激活和IVF方法的完善
3.2 孤雌卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因方法的初步研究
3.3 受精卵胞質(zhì)注射轉(zhuǎn)基因方法的初步研究
4 結(jié)論
第五章 豬單精子胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因影響因素研究
摘要
前言
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.2 儀器與設(shè)備
1.3 試劑配制
1.4 試驗方法
1.5 試驗設(shè)計
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
2 試驗結(jié)果
2.1 不同激活方法對豬ICSI胚胎發(fā)育的影響
2.2 不同外源基因濃度對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
2.3 精子與外源基因孵育時間對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
2.4 不同精子冷凍液和孵育液對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
2.5 不同精子處理方法和激活方法對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
2.6 激活后精子注射時間對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
2.7 激活后精子注射時間對不同發(fā)育時間合子內(nèi)谷胱甘肽含量的影響
2.8 激活后精子注射時間對豬ICSI胚胎原核形成的影響
2.9 不同外源基因載體對ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
2.10 單精子卵胞質(zhì)注射胚胎的體內(nèi)發(fā)育
3 分析與討論
3.1 不同激活方法對豬ICSI胚胎發(fā)育的影響
3.2 不同外源基因濃度對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
3.3 精子與外源基因孵育時間對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
3.4 不同精子冷凍液和孵育液對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
3.5 精子處理和激活對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
3.6 激活后精子注射時間對豬ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
3.7 不同外源基因載體對ICSI胚胎發(fā)育能力及轉(zhuǎn)基因效率的影響
3.8 單精子卵胞質(zhì)注射胚胎的體內(nèi)發(fā)育
4 結(jié)論
參考文獻
附圖
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況
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本文編號：
2860367
