發(fā)布時(shí)間：2018-04-21 18:48

  本文選題：橘小實(shí)蠅 + 腸道微生物��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：腸道微生物與宿主之間存在著廣泛的非致病關(guān)系,腸道共生微生物影響著宿主的生長發(fā)育、能量代謝、有害物質(zhì)降解、免疫防御系統(tǒng)成熟等。如大部分后生動物一樣,昆蟲腸道上皮細(xì)胞無時(shí)無刻不與微生物接觸,其種類從有益的共生菌、非共生菌、隨食物進(jìn)入的微生物到影響宿主生命的病原菌。在這樣一種復(fù)雜的環(huán)境中,為了實(shí)現(xiàn)防御腸道病原微生物的同時(shí)又能維持共生微生物穩(wěn)定的目的,宿主腸道上皮細(xì)胞必須在免疫應(yīng)激和免疫耐受之間保持一種穩(wěn)態(tài)平衡。Duox-ROS免疫系統(tǒng)和免疫缺陷(immune deficiency,Imd)信號通路作為腸道免疫反應(yīng)的基本途徑,必然參與調(diào)節(jié)此過程,然而人們對于宿主如何通過腸道免疫機(jī)制來維持其腸道微生物菌群穩(wěn)態(tài)以保持其功能的分子機(jī)理尚不清楚。本研究以橘小實(shí)蠅為研究對象,利用RNAi、qRT-PCR和Illumina MiSeq細(xì)菌16S rDNA高通量測序等分子生物學(xué)手段研究BdDuox基因在宿主腸道免疫及腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控中的重要作用;ROS對宿主生理功能的影響;闡述Imd信號通路在宿主免疫防御中的作用。1 Duox-ROS系統(tǒng)在腸道免疫和細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用通過克隆獲取橘小實(shí)蠅雙氧化酶(dual oxidase,BdDuox)基因編碼區(qū)核酸序列長度4584bp,該基因編碼1528個(gè)氨基酸,BdDuox蛋白具有7次跨膜結(jié)構(gòu),擁有典型的過氧化物酶結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)Duox-ROS防御系統(tǒng)在橘小實(shí)蠅腸道免疫防御中發(fā)揮著重要作用,橘小實(shí)蠅取食大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌6h和12h后,腸道BdDuox基因表達(dá)量和ROS水平顯著上調(diào);而取食腸道共生菌6h后,除次要菌群蠟樣芽孢桿菌能夠顯著誘導(dǎo)BdDuox基因表達(dá)量和ROS水平顯著上升外,其余5種腸道主要菌群均不能引起B(yǎng)dDuox基因的免疫響應(yīng),Duox-ROS免疫防御系統(tǒng)清除病原菌同時(shí)耐受腸道共生菌。注射BdDuox dsRNA后的1-7天,BdDuox基因表達(dá)量下調(diào)了26-54%,腸道ROS水平下降31-44%;注射BdDuox dsRNA后的9-17天,BdDuox基因上調(diào)了1.40-1.68倍,腸道ROS水平增加45-73%;而注射BdDuox dsRNA后的第20天,ds-duox干擾組BdDuox基因表達(dá)量和腸道ROS水平恢復(fù)到和ds-egfp對照組相一致水平。注射BdDuox dsRNA后的第5天和15天,橘小實(shí)蠅腸道細(xì)菌菌群密度分別增加了1.68和1.49倍,其中腸道主要菌群Enterobacteriaceae和Leuconostocaceae相對比例顯著下降,Bacillaceae、Bacteroidaceae、Verrucomicrobiaceae等次要菌群相對比例顯著增加,致使腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)紊亂;紊亂的腸道細(xì)菌群落反過來刺激宿主腸道上調(diào)表達(dá)BdDuox基因水平,介導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生來抑制次要菌群的過量增殖,最終在Duox-ROS系統(tǒng)調(diào)控下恢復(fù)腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)平衡。以上結(jié)果表明BdDuox基因在橘小實(shí)蠅腸道細(xì)菌群落穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。2 ROS對橘小實(shí)蠅成蟲生理功能的影響通過RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)BdCatalase基因在橘小實(shí)蠅腸道氧化還原平衡維持、成蟲生殖力和壽命中具有重要作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射BdCat dsRNA后的1-7天,相比于對照組,BdCat基因顯著下調(diào)了54.04-75.42%,而ds-cat干擾組腸道ROS水平上升了1.37-1.62倍;注射BdCat dsRNA后的第5天和10天,ds-cat干擾組腸道總細(xì)菌菌群密度分別下降了33.91%和34.78%。通過RNAi沉默BdDuox和BdCat基因研究ROS對宿主壽命的影響實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BdDuox和BdCat基因的沉默均不會影響宿主的平均壽命和總存活時(shí)間,但BdCat基因的沉默會延長宿主的中位生存期(Median survival time)。另外,本研究發(fā)現(xiàn)BdCat基因的沉默所造成的ROS水平上升會顯著降低宿主的產(chǎn)卵量和卵孵化率,ds-cat干擾組雌蟲在BdCat基因沉默后14-20天,單頭雌蟲日均產(chǎn)卵量下降了31.01-57.09%,ds-cat干擾組卵孵化率下降了25.45%;而BdDuxo基因的沉默所導(dǎo)致的ROS下降卻對宿主產(chǎn)卵量和卵孵化率無顯著影響。而通過喂食橘小實(shí)蠅化學(xué)物質(zhì)研究ROS對宿主壽命的影響實(shí)驗(yàn)中,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅取食百草枯和維生素C后7天,供試蟲體全部死亡,兩種化學(xué)物質(zhì)喂食所導(dǎo)致的ROS上升和下降大大降低了宿主壽命。3橘小實(shí)蠅IMD信號通路免疫防御功能研究通過對橘小實(shí)蠅進(jìn)行條件致病菌注射和喂食感染,研究Imd信號通路在宿主系統(tǒng)和腸道免疫反應(yīng)中的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DH5α注射侵染后會迅速激活I(lǐng)md信號通路系統(tǒng)免疫反應(yīng),BdDiptericin、BdRelish、BdPGRP-LB、BdPGRP-SB基因表達(dá)水平顯著上調(diào),而BdPGRP-SC2基因表達(dá)量在注射后的3-12h顯著下調(diào)了55.63-90.73%。大腸桿菌DH5α短期喂食感染只能夠誘導(dǎo)腸道Duox-ROS免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng),以及腸道Imd信號通路關(guān)鍵因子BdRel基因和BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的免疫響應(yīng)。在大腸桿菌DH5α喂食感染后的3-12h,BdDuox基因表達(dá)量顯著上調(diào)了1.70-2.89倍,卻不能誘導(dǎo)Imd信號通路效應(yīng)基因BdDpt的上調(diào)表達(dá)。在對PGRPs家族基因功能的研究中,我們發(fā)現(xiàn)BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因在橘小實(shí)蠅Imd信號通路中具有重要負(fù)調(diào)控作用,BdPGRP-LB、BdPGRP-SB和BdPGRP-SC2基因的沉默會導(dǎo)致Imd信號通路對大腸桿菌DH5α出現(xiàn)過激免疫響應(yīng)。在大腸桿菌DH5α長期連續(xù)喂食感染生測實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DH5α喂食感染的6h和12h只誘導(dǎo)Duox-ROS免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng),不能激活腸道Imd信號通路的免疫反應(yīng),與短期喂食感染結(jié)果相類似;而在大腸桿菌DH5α喂食感染后的第3天,能夠激活腸道Imd信號通路強(qiáng)烈免疫響應(yīng),大腸桿菌DH5α喂食后3-15天,腸道BdDpt基因上調(diào)了10.50-26.95倍;但腸道Duxo-ROS免疫系統(tǒng)在3-15天處于靜默狀態(tài),這些結(jié)果說明腸道Imd信號通路與Duox-ROS兩條信號的免疫響應(yīng)存在時(shí)序差異。另外,大腸桿菌DH5α的長期喂食能夠誘導(dǎo)脂肪體中BdDpt基因的上調(diào)表達(dá),大腸桿菌DH5α喂食后的5-15天,脂肪體中的BdDpt基因同樣出現(xiàn)上調(diào)了4.08-7.25倍,且H2O2和百草枯的喂食所導(dǎo)致的腸道內(nèi)ROS水平的增加能夠提前誘導(dǎo)腸道IMD信號通路對大腸桿菌DH5α的免疫響應(yīng),表明ROS在腸道Duox-ROS免疫防御系統(tǒng)和Imd免疫信號通路免疫互作中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:In order to protect intestinal pathogenic microorganisms and to maintain the stability of symbiotic microorganisms , the expression of BdDuox gene and immune deficiency ( Imd ) signal pathway in intestinal immunity and intestinal bacterial community can be maintained stably . The results show that the Duox - ROS system plays an important role in the immune defense of intestinal flora . The results showed that the BdCatalase gene plays an important role in the steady regulation of intestinal bacterial community in the small intestine . The results showed that Bdduox gene plays an important role in the steady regulation of intestinal bacterial community in the small intestine . The results showed that the expression of BdPGRP - LB , BdPGRP - SB , BdPGRP - LB , BdPGRP - SB , BdPGRP - LB , BdPGRP - SB and BdPGRP - sc2 decreased significantly .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1783685